本发明属于生物功能材料、分析检测技术领域，特别涉及制备模块化小室的分析检测装置，并用于捕获血液中稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞的技术。
背景技术：
血液中一些细胞的含量非常少，但是对于理解疾病很重要，比如干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。准确检测和分析这些稀有细胞，对理解疾病进程和发病机制非常关键，尤其是循环肿瘤细胞与癌症早期诊断密切相关。
循环肿瘤细胞(ctcs)是指从实体肿瘤病灶脱落，发生上皮-间质转化(emt)从而具有流动特性而进入外周血的肿瘤细胞。ctcs与肿瘤转移关系紧密，对癌症预后、早期诊断、疗效评估、复发预测以及个体化治疗等都有着重要的指导作用。然而，ctcs在外周血中的数量非常少，特别是对于早期癌症患者。研究表明78％的乳腺癌早期患者体内30ml全血中仅含有1-4个ctcs，尽管晚期病人的血液中含有几十或几百个ctcs/ml，但与周围存在数以百万计的白细胞和数十亿的红细胞相比依然相形见绌。因此大血量ctcs样本的高效捕获技术一直是研究的热点和难点。
近年来，ctcs捕获技术主要分为物理法和生物化学法。物理法主要是利用癌细胞与正常血细胞在尺寸、密度等方面的差异对癌细胞进行分离。物理法血液处理量大，能够在一小时内分离10-200ml的血液样本，但是低纯度的ctcs分离物一直是最大的技术障碍。生物化学法主要包括免疫磁珠法和微流控芯片法。美国强生公司的cellsearch磁珠ctcs捕获系统是最早由fda批准的临床应用技术，原理是通过磁珠表面的抗体与癌细胞表面的特异性抗原相识别来富集ctcs，可以检测7.5ml血液，但由于磁珠的粒径为100nm，容易被白细胞胞吞，因此cellsearch假阴性率高，这也是2015年底停产的重要原因。2007年哈佛医学院的mehmettoner团队第一次提出微流控芯片技术。微流控芯片法捕获ctcs的灵敏度高，但主要问题是尺度小、流速慢，导致单位时间处理血量有限。研究表明若要捕获率达到90％以上，流速一般控制为1-2.5ml/h，因此微流控技术难以用于大血量ctcs样本的捕获。文献small2015,11,3850、angew.chem.int.ed.2016,55,1252、chem.soc.rev.,2017,46,4245综述了近年来ctcs捕获的方法和技术，也提出了一些存在的问题。如物理法分离纯度低；磁珠法捕获效率低，操作复杂，不具备广谱性；微流控芯片制备过程复杂，成本高，细胞富集时间较长等。因此，现有方法对于大血量循环肿瘤细胞的高效捕获均具有局限性。此外，中国专利cn201610102092.3、cn201610590052.8、cn201510205773.8、cn201310547812.3中报道的ctcs捕获技术也很难克服上述的问题。
技术实现要素：
基于现有方法中的微流控方法处理量太小、物理法分离纯度低、无法同时实现待检稀有细胞大容量与高效率捕获的技术问题，本发明提出模块化小室这一全新的设计思路。该模块化小室结构简单，使用方法操作简单，成本低廉，其特点在于通过调控搭建容置腔模块的数量，可调控待检血液的处理量，能够在短时间内实现血液中稀有细胞的快速检测，尤其适合大血量待检细胞样本；并且小室中的细胞捕获基片具有对稀有细胞的高效特异性识别功能，可实现对稀有细胞样本，尤其是ctcs样本的高效率捕获。具体的技术方案如下：
首先，本发明提供一种模块化小室。其由上封板、下封板与至少一个容置腔模块组成，所述容置腔模块的底面为细胞捕获基片，所述上封板和/或下封板上设置有液体通孔。
对于上文所述的模块化小室，具体的，所述容置腔模块设置的目的为承载待检液体；因此，本发明对其具体设置的侧立面并不加以限定，只需要保证其承载液体不外流，确保密闭性即可，同时，此容置腔模块的底面，因为是作为待检细胞的接触面，尤其是用于接触液体中仅仅含有少量稀有细胞的接触面，因此，容置腔模块的底面必须设置成细胞捕获基片。
对于上文所述的模块化小室，具体的，所述容置腔模块由可拆卸的细胞捕获基片和能与细胞捕获基片配合使用的环形垫圈组成。这种环形垫圈可以与底面的细胞捕获基片构成容置空间，用于承载待检液体。其中，所述的垫圈为弹性橡胶材料。所述的垫圈厚度需根据待检测目标物的不同而定，通常情况下选择血检细胞为检测对象时，垫圈的厚度小于或等于30mm即可，以便重复的沉降细胞至细胞捕获基片上。本发明中，根据具体的实验确定的优选厚度为1～15mm。
对于上文所述的模块化小室，具体的，所述的细胞捕获基片具有细胞微纳拓扑结构表面。所述的细胞微纳拓扑结构表面是与模板细胞互补的微纳拓扑结构表面，其中，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞，包括癌细胞、白细胞、吞噬细胞等多种哺乳动物的组织细胞。因为这些细胞具有丰富的微纳米结构，其中细胞表面的微突体提供微米结构，细胞铺展的伪足提供纳米结构。
对于上文所述的模块化小室，具体的，在所述的与模板细胞互补的微纳拓扑结构表面上，还修饰有细胞特异性识别抗体。所述的细胞特异性识别抗体为待捕获稀有细胞的特异性识别抗体；所述稀有细胞包括干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。所述的细胞微纳拓扑结构表面的材料为聚二甲基硅烷、过氧化聚吡咯、聚氨酯中的一种。
对于上文所述的模块化小室，具体的，所述的上封板和下封板材质为不与容置腔模块内部所需承载的液体样本反应或结合的惰性材料，例如：高分子材料或无机材料，具体的如pmma、或者玻璃、陶瓷等。这些材料具有化学惰性，在环境中能够保持稳定，不与容置腔模块内部所需承载的液体样本反应或结合。
对于上文所述的模块化小室，具体的，所述细胞捕获基片上还设置有通孔，用于液体的流通。
对于上文所述的模块化小室，通过调控搭建容置腔模块的数量，可调控样本血液的处理量，能够得到处理大容量血液样本的模块化小室；具体的，当容置腔模块设置2层以上时，相邻两层容置腔模块的通孔设置的位置在垂直方向上呈最远距离设置，以实现液体的流入方式为自下而上“蛇形”充满小室。
对于上文所述的模块化小室，具体的，上封板的液体通孔为液体出口；下封板的液体通孔为液体入口。这种结构的设置有利于克服大气压力，最大程度的使液体充满每一层模块，不会留下气泡。本发明的实施例中，具体列举了模块化小室在处理ctcs血液样本时，液体从下封板的流入口注入，自下而上“蛇形”充满小室，静态捕获一段时间后，从上封板的流出口流出，进行后续的检测。
本发明的另一方面在于，利用上文所述的模块化小室，在高效捕获血液中稀有细胞中的应用，稀有细胞包括干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。
对于上文所述的应用，具体的，所述的应用包括模块化小室在早期癌症患者循环肿瘤细胞检测中的应用。因为早期患者体内ctcs含量太少，必须要大容量的样本才能保证检测效果。通过调控搭建容置腔模块的数量，可调控血液样本的处理量，能够得到处理大容量血液样本的模块化小室，从实施例列举的数据证实了，利用本发明所述的模块化小室能够实现癌症中早期患者大血量ctcs样本的高效捕获。
本发明的实施例实验结果表明，本发明的模块化小室所能处理的血液容量大，每层小室都可处理较大量血液样本，叠加多层时，其处理量加倍；从而可以实现大量血液的快速捕获。结合高效率细胞捕获基片，模块化小室对待检稀有细胞的粘附性及特异性能优越，由实施例的数据可见，对于中早期及晚期病人痕量ctcs人造血样的捕获率可达到80％，且捕获纯度可达90％以上。因此，本发明所述的模块化小室的应用，克服了近年来ctcs捕获方法的一些缺陷，兼具物理法大血量处理能力及微流控技术高效捕获的优势，实现大血量稀有细胞样本的高效捕获。
本发明与现有的循环肿瘤细胞捕获技术相比具有以下特点：
1.本发明的模块化小室结构简单，便于生产组装。
2.本发明的模块化小室的制备方法简单快速，不需要复杂的表面刻蚀技术。此外，通过调控容置腔模块数量能够处理不同血液量，应对不同容量的血液样本灵活便捷。
3.本发明的模块化小室能够实现大血量稀有细胞样本的快速捕获，克服了微流控芯片血液处理量小的缺陷，有望用于中早期癌症患者大血量ctcs样本的高效捕获。
4.本发明所提供的模块化小室，能够结合任意一种细胞捕获基片，实现对不同癌细胞类型的高效特异性捕捉，应用范围广泛。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的模块化小室的主视图。
图2为本发明实施例1制备的模块化小室的俯视图。
图3为本发明实施例1制备的模块化小室的立体图。
图1～3中：1.上封板；2.下封板；3.容置腔模块；4.细胞捕获基片；5.液体通孔；6.环形垫圈；7.液体出口；8.液体入口。
图4为本发明实施例1模块化小室中ctcs捕获基片的扫描电镜照片，比例尺为1微米。
图5为本发明实施例1的模块化小室对不同癌细胞系的捕获效率柱状图。
图6为本发明实施例2的模块化小室对不同数量ctcs人造血样的捕获效率点状图。
图7为本发明实施例2的模块化小室对不同数量ctcs人造血样的捕获纯度点状图。
图8为本发明实施例3的模块化小室的对模拟癌症中早期及晚期患者体内不同数量癌细胞的捕获效率及捕获纯度的柱状图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
本发明的用于大血量循环肿瘤细胞高效捕获的模块化小室的制备方法包括以下步骤：
(1)准备两块高分子材料、或无机材料的平板，分别作为上封板1和下封板2；并在其表面上分别设置液体出口7和液体入口8。液体从下封板的液体入口8注入，自下而上“蛇形”充满小室，静态捕获一段时间后，从上封板的液体出口7流出，进行后续的检测。
(2)准备若干块ctcs捕获基片4，基片具有高效ctcs捕获性能，其尺寸应稍小于上封板1和下封板2的尺寸。
(3)准备和ctcs捕获基片4相同数量的环形垫圈6，环形垫圈6为具有中空结构的弹性橡胶材料，且其尺寸应稍小于ctcs捕获基片4的尺寸，但厚度需小于或等于10mm。
(4)将步骤(2)中的每个ctcs捕获基片4上设置一个开口作为液体通孔5，并与步骤(3)中的环形垫圈6组装成一个容置腔模块3。每层容置腔模块3组合时液体通孔5的方向设置在对角线的位置。
(5)将步骤(4)中的容置腔模块3与上封板1和下封板2组装，得到模块化小室。并且通过调控容置腔模块3数量能够处理不同血液量，实现中早期癌症患者大血量ctcs样本的快速捕获。
对于上文所述的模块化小室，具体的，本发明的细胞捕获基片的制备方法包括以下步骤：
(1)将上文所述的模板细胞接种在细胞培养皿或其他细胞培养的基面进行增殖培养；
(2)将步骤(1)中的细胞用多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛固定后，通过无水乙醇脱水使细胞收缩，从而得到坚硬粗糙的模板细胞表面；
(3)将高分子预聚物(选自聚二甲基硅烷、过氧化聚吡咯或聚氨酯)浇在步骤(2)得到的模板细胞表面，高分子预聚物热固交联固化后，将其剥离得到细胞微纳拓扑结构表面。
(4)将步骤(3)中细胞微纳拓扑结构表面通过化学偶联法或生物亲和法连接上稀有细胞特异性识别的抗体获得终产品——细胞捕获基片，可以广泛用于从血液中高效捕获目标的稀有细胞。
实施例1
本实施例选用有机玻璃分别作为上封板1和下封板2，镶嵌注射器针头作为液体出口7和液体入口8，ctcs捕获基片4为细胞复刻聚二甲基硅烷(pdms)表面，通过螺钉组装制备模块化小室；通过考察模块化小室对不同种类癌细胞的捕获效率，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1)模块化小室的制备：
首先准备两块60mm×40mm的有机玻璃平面分别作为上封板1和下封板2，将注射器针头镶嵌其中作为液体出口7和液体入口8。然后准备若干块50mm×30mm的ctcs捕获基片4，和相同数量的40mm×25mm×3mm的“回”形橡胶垫圈6。每一块ctcs捕获基片4在角上设置一个小孔作为液体通孔5，用于液体的流通，然后将ctcs捕获基片4与垫圈6组合即构成一层容置腔模块3，其容积为3ml。最后，将容置腔模块3分别与上封板1和下封板2用螺钉组装构成模块化小室，其中容置腔模块3的数量可以调控，每层ctcs捕获基片4的液体通孔5在垂直方向上呈最远距离设置，以实现液体的流入方式为自下而上“蛇形”充满容置腔模块3(图1～图3)。
2)ctcs捕获基片4的制备：
将模板细胞人乳腺癌细胞(mcf-7)细胞以25000个/cm2的密度接种在培养皿中，并放置在37℃的co2细胞培养箱中，24小时之后用4％质量浓度的多聚甲醛溶液固定20分钟，固定后的细胞在无水乙醇中脱水30分钟并干燥，得到模板细胞表面。然后将pdms预聚物浇筑在模板细胞表面，在80℃热固交联6小时后，剥离得到细胞复刻pdms表面并通过扫描电镜观察(图4)。并使用生物亲和法在其细胞复刻pdms表面连接上anti-epcam特异性抗体。
3)准备待测的循环肿瘤细胞样品：
mcf-7细胞及人宫颈癌细胞(hela细胞)均在dmem细胞培养基中培养，另外人肺癌细胞(a549细胞)及人肝癌细胞(hepg2细胞)均在rpmi-1640细胞培养基中培养。分别取各细胞悬浮液100μl，用细胞计数器计数并计算其浓度；吸取一定量的上述细胞悬浮液，用各自细胞培养基稀释至1×105个细胞/ml。
4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞：
准备四个步骤1)中模块化小室，将其放置在试验台面，然后通过注射器将步骤3)的混合均匀的各细胞悬浮液从小室下表面的液体入口8注入，待血样自下而上充满小室后将下表面的液体入口8用封口膜密封；然后置于37℃的co2细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。
5)捕获效果的评价：
捕获时间结束后，用注射器从下表面的液体入口8注入磷酸盐缓冲液(pbs)清洗三次，废液均由上表面的液体出口7收集后统一处理；然后从流入口注入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，封口膜密封后在细胞培养箱中释放5分钟；释放时间结束后，迅速将含有细胞的胰蛋白酶溶液收集在细胞培养板中，并使用fda荧光染料染色2分钟。最后在olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照，在不同视野下随机拍取20张荧光照片，利用imagej软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
实验结果表明，模块化小室对anti-epcam阳性癌细胞(mcf-7细胞和hepg2细胞)的捕获率可达到90％，对anti-epcam阴性癌细胞(hela细胞及a549细胞)的捕获率亦可达到72％(图5)。表明该方法制备的模块化小室可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获并且具有广谱性。
实施例2
本实施例选用细胞复刻表面作为模块化小室的ctcs捕获基片，向全血中加入不同数量的mcf-7细胞为待捕获的ctcs人造血样模型；并对被捕获的癌细胞及白细胞进行扫描电镜观察，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1)模块化小室制备方法与实施例1相同。
2)ctcs捕获基片4的制备方法与实施例1相同。
3)准备待测的循环肿瘤细胞样品：
此处的mcf-7细胞预先用dapi染料染色使其带有蓝色荧光。取预先染色的mcf-7细胞悬浮液100μl，用细胞计数器计数，用dmem细胞培养基稀释至1×103个细胞/ml的浓度待用；取9ml新鲜抗凝血，平均分为9份，分别向其中加入癌细胞数量为10、20、50、100、200、400、600、800和1000的mcf-7细胞，混合均匀。向ctcs人造血样中加入红细胞裂解液(北京索莱宝生物科技)，并通过离心法分离杂质，最后得到含有mcf-7细胞的外周血单核细胞悬浮液，白细胞浓度约为0.8×106个细胞/ml。
4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞：
准备四个步骤1)中模块化小室，将其放置在试验台面，然后通过注射器将步骤3)的混合均匀的各细胞悬浮液从小室下表面的液体入口8注入，待血样自下而上充满小室后将下表面的液体入口8用封口膜密封；然后置于37℃的co2细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。
5)捕获效果的评价：
捕获时间结束后，用注射器从下表面的液体入口8注入磷酸盐缓冲液(pbs)清洗三次，废液均由上表面的液体出口7收集后统一处理；然后从液体入口8注入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，封口膜密封后在细胞培养箱中释放5分钟；释放时间结束后，迅速将含有细胞的胰蛋白酶溶液收集在细胞培养板中，并使用fda荧光染料染色2分钟(此时预先dapi染色的癌细胞带有蓝色荧光，而fda染色的癌细胞与白细胞均带有绿色荧光)；最后在olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照，在不同视野下随机拍取20张荧光照片，利用imagej软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率及捕获纯度。
实验结果表明，模块化小室对ctcs人造血样中癌细胞的捕获效率较高，平均能达到85％(图6)；背景细胞粘附少，癌细胞的捕获纯度能达到92％(图7)。表明该方法可以实现从ctcs人造血样中高效特异性地捕获循环肿瘤细胞。
实施例3
本实施例选用具有不同模块数的模块化小室；以中早期及晚期癌症患者体内癌细胞数量模拟制备ctcs人造血样，探究模块化小室的捕获效果。对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1)模块化小室制备方法与实施例1相同。但此处将一层模块的模块化小室作为晚期癌症患者捕获装置；将三层模块的模块化小室作为中早期癌症患者捕获装置。
2)ctcs捕获基片的制备方法与实施例1相同。
3)模拟不同患者的ctcs人造血样的制备：
中早期癌症患者体内ctcs数量很少，模拟ctcs人造血样为1个ctc/ml，因为ctcs数量太少，所以检测样本至少需要9ml血液才具有一定的可靠性；而晚期患者体内ctcs数量相对较多，模拟ctcs人造血样为10个ctcs/ml，检测样本需要3ml血液即可。上述两种模拟不同患者ctcs人造血样的制备方法与实施例2相同。
4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞：
将步骤1)中模块化细胞复刻小室放置在试验台面，然后通过注射器将步骤3)的模拟不同患者的ctcs人造血样从小室下表面的液体入口8注入，待血样自下而上充满小室后将下表面的液体入口8用封口膜密封；然后置于37℃的co2细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。
5)捕获效果的评价：
捕获时间结束后，用注射器从下表面的液体入口8注入磷酸盐缓冲液(pbs)清洗三次，废液均由上表面的液体出口7收集后统一处理；然后从液体入口8注入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，封口膜密封后在细胞培养箱中释放5分钟；释放时间结束后，迅速将含有细胞的胰蛋白酶溶液收集在细胞培养板中，并使用fda荧光染料染色2分钟(此时预先dapi染色的癌细胞带有蓝色荧光，而fda染色的癌细胞与白细胞均带有绿色荧光)；最后在olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照，在不同视野下随机拍取20张荧光照片，利用imagej软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率及捕获纯度。
实验结果表明，模块化小室可以在60分钟这一较短时间内实现大量血液的快速处理，对癌细胞的捕获效率及捕获纯度性能优越，模拟中早期及晚期病人痕量人造ctcs血样的捕获率可达到80％，且捕获纯度可达90％以上(图8)。此结果能够匹敌具有高灵敏度、高纯度的微流控技术，并且克服了其短时间内处理血量少的缺点，可以实现癌症中早期患者大血量(大于等于9ml/h)ctcs样本的高纯度(大于等于90％)捕获，有望用于循环肿瘤细胞的中早期诊断。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。