本发明涉及一种组织芯片制作的量产方法，用于制备超高产量的组织芯片，属于组织芯片技术领域。
背景技术：
组织芯片技术是基因芯片技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片一样，属于一种特殊生物芯片技术。组织芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片上进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。组织芯片技术使科研人员能同时对几百甚至上千种组织样本同时进行分析，进行某一个或多个特定的基因，或与其相关的表达产物的研究。该技术可以与dna、rna、蛋白质、抗体等技术相结合，与传统的病理学技术、组织化学及免疫组化技术相结合，在基因、基因转录和相关表达产物生物学功能三个水平上进行研究。这对人类基因组学的研究与发展，尤其对基因和蛋白质与疾病关系的研究，疾病相关基因的验证、新药物的开发与筛选、新抗体的制备与筛选、疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面具有实际意义和广阔的市场前景。
美国clontech和stratagene等生物技术公司已开展了人及动物的组织芯片产品开发和销售，但数量少、价格高、品种单一，满足不了医学科研和医药工业研发的需要。2001年4月，美国lifespan生物科学公司建立了正常和疾病组织基因表达数据库。美国tissuelnformactics公司用动物组织芯片技术进行药物毒理筛选和寻找新药物作用位点。此外，日本、英国等国均筹建了国家临床组织病理数据库。
中国在组织芯片技术方面的研究进展迅速。2001年10月，中国国家科技部将组织芯片技术列为“十五”国家科技攻关西部开发重大项目，并已在西安正式立项。该立项分成7个子项目，包括组织芯片技术、组织芯片生物信息数据库、自动化组织芯片仪、自动分析装置、组织芯片相关技术与试剂、组织芯片实际应用技术，为中国与世界相关技术同步发展奠定了基础。
经过十余年的发展，目前，组织芯片的制备主要依靠机械化芯片制备仪来完成。制备仪包括操作平台、特殊的打孔采样装置和一个定位系统。打孔采样装置对供体组织蜡块进行采样，同时也可对受体蜡模进行打孔，其孔径与采样直径相同，两者均可精确定位。制备仪的定位装置可使穿刺针或受体蜡模线性移动，从而制备出孔径、孔距、孔深完全相同的组织微阵列蜡块。通过切片辅助系统将其转移并固定到硅化和胶化玻片上即成为组织芯片。根据样本直径(0.2～2.0mm)不同，在一张45mm×25mm的玻片上可以排列40～2000个以上的组织标本。一般按照样本数目的多少，将组织芯片分为低密度芯片(<200点)、中密度芯片(200～600点)和高密度芯片(>600点)。常用组织芯片含有组织标本的数目在50～800个之间。根据研究目的不同，芯片种类可以分成肿瘤组织芯片、正常组织芯片、单一或复合、特定病理类型等数10种组织芯片。
但依据上述方法制备组织芯片有以下不足：第一，现有组织芯片制作成本很高。除特殊的仪器设备外(数十万元)，制作1个组织芯片的费用在万元以上，每张切片单价在50～100元；第二，仅能在已有的蜡块上取样，组织来源受到限制；第三，根据现有设备和方法制备的芯片，切片量仅约50张后就开始丢失芯片点，因为是在原有蜡块上点孔取样，组织厚度有限，组织厚度也不一致；第四，高密度芯片虽然通量大，但由于每枚组织微小，难以提供组织结构的信息；第五，只能用石蜡组织制备组织芯片，不能用新鲜组织和培养的细胞制备组织芯片；第六，仅在大型研究单位，才有经费和条件进行组织芯片的相关研究，难以推广。第七，现有组织芯片方法无法实现量产，难以满足大范围临床和科研的需求。
技术实现要素：
本发明的目的是开发一种简易的组织芯片量产制作方法，制备低密度和中密度组织芯片，兼顾样本通量、组织结构、新鲜组织、福尔马林或酒精等其他溶剂固定的组织、石蜡或其他支持剂填充的组织以及培养的细胞等，尤其是组织芯片的高产量等多方面的要求，使组织芯片技术的作用得到充分发挥。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种组织或细胞芯片量产制作方法，其特征在于，包括：将组织粒、培养的细胞或收集的脱落细胞(如胸腹水脱落细胞)用塑形装置塑形，所述的组织粒通过采用组织搅拌机搅碎新鲜组织、福尔马林或其他溶剂(如酒精等)固定的组织、或石蜡包埋的组织块，将塑形后的组织或细胞种入受体蜡模或粘连在金属板上，切片，即获得组织或细胞芯片。
所述的组织搅拌机搅拌后的组织粒形状不规则，但仍保留有组织结构。
优选地，所述的组织粒大小在0.01cm～0.3cm。
优选地，采用组织搅拌机搅碎福尔马林或其他溶剂固定的组织形成的组织粒的塑形方法包括：收集采用组织搅拌机搅碎福尔马林或其他溶剂固定的组织形成的组织粒，用棉布包裹，编号后脱水浸蜡；打开组织芯片包埋机，将组织粒放在组织芯片包埋机的烫台上，在50～70℃将其上的石蜡融化，即为待塑形的组织粒；将塑形管置入组织芯片包埋机烫台上的凹槽中；将组织粒塞入塑形管内，加入融化的石蜡填充塑形管内组织粒间的缝隙；将充满组织粒和石蜡填充缝隙的塑形管从烫台转入组织芯片包埋机的冻台聚合，获得装有塑形后的组织芯的塑形管，编号存放，使用前将塑形管剥除，得到塑形后的组织芯。
更优选地，所述的塑形管为1～2cm长，直径0.1～0.3cm的圆柱形塑料管，或者，所述的塑形管为长为1～2cm，宽为0.1～0.5cm，高为0.1～0.5cm的长方体形塑形管。
更优选地，所述的塑形管长2cm，直径0.3cm。形状、大小和内径也可以根据需要调整。
更优选地，所述的组织芯可利用的长度为1cm-1m，优选2cm，预计可连续切2000片。
优选地，所述的将塑形后的组织或细胞种入受体蜡模的方法包括：将受体蜡模放在玻璃板上，置入50-70℃恒温烤箱20-40分钟，使受体蜡模变软，在定位板或定位纸上记录相应位置的组织或细胞编号，用引导针在受体蜡模相应位置钻孔，将塑形后的组织或细胞逐个种入，种入完成后，将种入面朝向玻璃板，放在50-70℃恒温烤箱聚合1-5小时，将受体蜡模和玻璃板同时置入2-6℃冰箱，将玻璃板撤出，即获得接种组织或细胞的受体蜡模，沿平行于玻璃板方向切片即获得组织或细胞芯片。
优选地，所述的将塑形后的组织或细胞粘连在金属板上的方法包括：将金属板置于冰箱中，金属板上标记有定位点，取出冷冻塑形后的组织或细胞，在定位板上记录位置，将塑形后的组织或细胞的一端涂抹少许包埋剂，逐一粘连在金属板的定位点上，之后用包埋剂将塑形后的组织或细胞间的空隙填充，包埋剂与塑形后的组织或细胞冷冻为一体，用冷冻切片机切片，即获得组织或细胞芯片。
更优选地，可以根据需要选择不同组合的组织或细胞种入受体蜡模。
优选地，所述的采用组织搅拌机搅碎石蜡包埋的组织块形成的组织粒的塑形方法包括：将组织搅拌机搅碎石蜡包埋的组织块形成的组织粒收集起来，将塑形管置入组织芯片包埋机烫台上的凹槽中；将组织粒塞入塑形管内，加入融化的石蜡填充塑形管内组织粒间的缝隙；将充满组织粒和石蜡填充缝隙的塑形管从烫台转入组织芯片包埋机的冻台聚合，获得装有塑形后的组织芯的塑形管，编号存放，使用前将塑形管剥除，得到塑形后的组织芯。
优选地，所述的采用组织搅拌机搅碎新鲜组织形成的组织粒的塑形方法包括：将组织粒移入至新鲜组织粒塑形板上，新鲜组织粒塑形板为有弹性的塑料板，塑料板上有凹槽，将新鲜组织粒吸入凹槽，将新鲜组织粒塑形板置于-15～-25℃冰箱，即形成新鲜组织冻存柱，编号，备用。
更优选地，所述的凹槽的长2cm，宽0.2cm～0.5cm，高0.2cm～0.5cm。
优选地，所述的将培养的细胞或收集的脱落细胞用塑形装置塑形的方法包括：将培养的细胞或收集的脱落细胞直接采用常规方法固定、脱水、浸蜡，将塑形管置入组织芯片包埋机烫台上的凹槽中，将浸蜡后的细胞置入塑形管内，加入融化的石蜡填充缝隙；将塑形管从烫台转入组织芯片包埋机的冻台聚合，获得塑形后的细胞，编号存放。
优选地，所述的塑形管可以有不同形状和规格，所述的组织芯片包埋机的凹槽可以用不同大小。
优选地，所述的受体蜡块为方形、圆形或其他形状。
本发明利用将一块组织搅碎为组织粒，组织粒仍保存有一定的组织结构为基础，再利用石蜡易溶解、易聚合的特性，先用少量石蜡将组织粒黏附在一起，塑形后成为圆柱体等形状，作为制备组织芯片的组织芯备用。或利用新鲜组织粒塑形板冷冻塑形，作为制备新鲜组织芯片的组织芯备用。
本发明具有廉价、方便、快速、产量显著提高、取材多样、既可用于石蜡组织、又可用于新鲜组织和培养或脱落细胞的优点，能普及至每一个病理科及相关研究单位。制作的组织芯形状不受限制，可塑形为长条形，长方形，方形，圆柱形，圆筒形；组织芯和组织芯片的大小可根据需要而定，在50mm×25mm的面积上可排列20～100个组织芯，能满足研究需要；也可以组合制备为免疫组织化学的阳性对照芯片，排列1～10个组织芯。组织芯片的高度也可根据需要而定，在5mm～20mm高的组织芯片上可切制500张～2000张切片，远高于现有组织芯片切制50张切片的产量，约为10～40倍；现有组织芯片制备方法在切片过程中，逐步出现组织芯丢失的现象，而此方法制备的组织芯片，由于组织芯长度一致，因此，不会出现后续切片丢失组织芯的情况；以2cm×2cm×0.2cm的一枚组织为例，按照现有组织芯片取样方法，最多取10个点，每个点以切制50～200张芯片计算，可以获得500～2000片芯片，若搅拌为组织粒后，可以获得5～10根2cm×0.3cm×0.3cm的组织柱，合计可以获得1～2万片含此枚组织的组织芯片；以胎盘组织为例，组织量充足，搅拌为组织粒后，可以方便快速地制作1000个组织柱，可以获得200万片含胎盘组织的组织芯片，因此，组织粒的方法突破了组织芯片量产的瓶颈，省略了昂贵的组织芯片取样机这一设备，其成本远低于现有制作方法，为组织芯片的普及应用开辟了便捷的新方法。
本发明具有廉价、方便、快速、量产、塑形多样的优点，可用于新鲜组织、固定的组织、石蜡包埋组织、培养或胸腹水等脱落细胞，能普及至每一个病理科及相关研究单位。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种组织芯片量产制作方法，具体步骤为：
第一步：病理取材时留取所需的组织，用福尔马林固定，编号，用组织搅拌机搅碎形成组织粒，收集组织粒，用棉布包裹，随同病理科常规组织处理程序，编号后脱水浸蜡；
第二步：打开组织芯片包埋机，将组织粒放在组织芯片包埋机的烫台上，在60℃将组织粒上的石蜡融化，即为待塑形的组织粒，将塑形管置入组织芯片包埋机烫台上的凹槽中，所述的塑形管为长2cm、直径0.3cm的圆柱形塑料管，将待塑形的组织粒塞入塑形管内，加入少许融化的石蜡，填充组织粒间的缝隙，根据组织量，一次至少制备5根组织芯片；
第三步：将充满组织粒和石蜡填充缝隙的塑形管从烫台转入组织芯片包埋机的冻台聚合，获得装有塑形后的组织芯的塑形管，编号存放；使用前将塑形管剥除，得到塑形后的组织芯；
第四步：将50mm×25mm的受体蜡模放在玻璃板上，置入50℃恒温烤箱内30min，芯片种入面朝上，使受体蜡模变软。在定位板或定位纸上记录相应位置的组织编号，用引导针在受体蜡模相应位置钻孔，将塑形后的组织或细胞逐个种入；
第五步：种入完成后，将受体蜡模种植面朝向玻璃板，一同置入56℃恒温烤箱聚合60分钟，待聚合后，将受体蜡模和玻璃板同时置入4℃冰箱，将玻璃板撤出，即获得接种组织或细胞的受体蜡模，沿平行于玻璃板方向切片即获得组织芯片。同一病例的5根组织芯可以参与5个组织芯片的制备。从而可以获得1万片芯片。
实施例2
一种组织芯片量产制作方法，具体步骤为：
第一步：病理取材时留取所需的新鲜组织，编号，用“组织搅拌机”搅拌为组织粒；
第二步：将组织粒用吸管移入新鲜组织粒塑形板的凹槽中，新鲜组织粒塑形板为有弹性的塑料板，塑料板上有凹槽，凹槽长2cm，宽0.3cm，深0.3cm，将新鲜组织粒塑形板置于-20℃冰箱，将组织粒冷冻塑形为新鲜组织冻存柱；
第三步：利用新鲜组织粒塑形板的弹性，将已塑形的新鲜组织芯松动，用镊子取出，编号，新鲜组织芯冻存备用。
第四步：将50mm×25mm的金属板置于-20℃冰箱，金属板上标记有定位点，取出新鲜组织芯，在定位板上记录位置，将新鲜组织芯的一端涂抹少许包埋剂(oct包埋剂，sakurafinetekjapanco，ltd，tokyo，135-0007)，逐一粘连在金属板的定位点上，之后用包埋剂将新鲜组织芯间的空隙填充，包埋剂与组织芯冷冻为完整的新鲜组织芯片，用冷冻切片机切片，即获得新鲜组织芯片。同一病例的20根组织芯可以参与20个组织芯片的制备。从而可以获得4万片芯片。
实施例3
一种组织芯片量产制作方法，具体步骤为：
第一步：离心沉淀获得胸水脱落细胞，直接采用常规方法福尔马林固定，用棉布包裹，随同病理科常规组织处理程序，脱水、浸蜡；
第二步：将浸蜡的脱落细胞放在组织芯片包埋机的烫台上，在62℃将组织粒上的石蜡融化，将塑形管置入组织芯片包埋机烫台上的凹槽中，所述的塑形管为长为2cm，宽为0.2cm，高为0.2cm的长方体形塑形管，将浸蜡后的细胞置入塑形管内，加入融化的石蜡填充缝隙；根据细胞量，一次制备10根细胞芯片；
第三步：将塑形管从烫台转入组织芯片包埋机的冻台聚合，获得塑形后的细胞，编号存放。
第四步：将50mm×25mm的受体蜡模放在玻璃板上，置入52℃恒温烤箱内30分钟，芯片种入面朝上，使受体蜡模变软。在定位板或定位纸上记录相应位置的细胞编号，用引导针在受体蜡模相应位置钻孔，剥除1根塑形后的细胞芯外层的塑料管，将不同的细胞芯逐个种入受体蜡模中。
第五步：种入完成后，将受体蜡模种植面朝向玻璃板，一同置入56℃恒温烤箱聚合60分钟，待聚合后，将受体蜡模和玻璃板同时置入4℃冰箱，将玻璃板撤出，即获得接种细胞的受体蜡模，沿平行于玻璃板方向切片即获得细胞芯片。同一病例的10根组织芯可以参与10个细胞芯片的制备。从而可以获得2万片芯片。