本发明涉及辅助生殖治疗技术领域，具体涉及一种用于激活icsi后未受精卵母细胞的试剂盒及应用方法。
背景技术：
在辅助生殖治疗周期中约有35-40％的不孕患者来自男性因素，单精子注射(icsi)是解决男性因素(少弱精、生精功能低下，睾丸穿刺取精子等)体外受精的主要技术，但icsi的平均受精率仅有70％左右，大约3％的icsi周期发生完全受精失败。icsi受精失败直接导致人卵子不能继续发育，辅助生殖治疗失败。
卵子人工激活(artificialoocyteactivation，aoa)针对icsi受精失败或受精率低的患者通过钙离子载体处理icsi后的卵母细胞，使其细胞内钙离子浓度升高，模拟正常受精时卵母细胞内的生理变化，使发育停滞的胚胎继续发育从而达到挽救受精失败的目的。
人类胚胎受精的关键事件是精子进入卵子后释放激活因子，使卵母细胞细胞质内的钙离子浓度升高而形成钙振荡，进而形成钙波，从而启动后续生物学事件。而icsi受精失败的主要原因是精子或卵子存在缺陷，导致钙离子浓度不能升高，后续生物学事件无法启动，胚胎不能继续发育。卵子人工激活的主要原理是人为地使卵母细胞质的钙离子浓度升高，现有的卵子激活技术主要包括机械法激活、电激活和钙离子载体激活。
机械法主要通过在icsi过程中，使用注射针对卵母细胞细胞质的大幅度抽吸达到破坏内质网释放钙离子的目的。这种方法成功的报道较少，且在抽吸操作过程中容易造成卵母细胞死亡，因此并不被临床广泛采用。
电激活法主要通过外加电场对卵母细胞进行瞬时高电压刺激，使细胞膜产生小孔将溶液中的钙离子引入细胞内，这种方法需要特殊的细胞融合仪，但细胞融合仪在辅助生殖实验室并不是常用设备，而且电激活也会对卵母细胞造成一定的机械和电离损伤。因此在临床上应用也具有局限性。
钙离子载体法是将卵母细胞置于含有钙离子载体的溶液中培养，通过钙离子载体或将溶液中的钙离子引入细胞内或诱导卵母细胞自身内质网的钙库释放钙离子。虽然采用钙离子载体进行卵母细胞激活具有试剂准备简便；对卵母细胞无机械损伤；不需要细胞融合仪的优点。但是，现有的钙离子载体激活方法依然存在操作步骤繁琐、卵母细胞与激活剂接触时间长以及激活效率偏低的缺陷。
存在于卵子细胞质内的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(pip2)是卵子受精激活后发生钙振荡的关键底物，正常受精时被精子特异性的磷脂酶c水解成insp3和dag，而insp3与内质网上的受体结合后开放钙离子通道从而将钙离子释放进卵细胞质内，形成钙振荡。研究表明使用阻断物质人为地降低卵细胞内pip2的分布密度会导致钙振荡的失败，而去除pip2的阻断物后钙振荡可以恢复。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明人创新性地将pip2作为补充底物加入到钙离子载体的激活剂中，可以针对因卵子中缺乏pip2所导致的激活失败起到一定的作用，增加了卵母细胞的激活几率，适用范围更广。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于激活icsi后未受精卵母细胞的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
1)钙离子载体溶液；
2)磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸溶液。
进一步地，所述钙离子载体为离子霉素或离子霉素钙盐。
优选地，所述钙离子载体的浓度为0.5-1.5mm，所述磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的浓度为0.5-1.5mm。
进一步地，所述试剂盒包括以下组分：
1)离子霉素钙盐的二甲基亚砜溶液；
2)磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的二甲基亚砜溶液。
进一步地，所述试剂盒的适用范围包括：有icsi受精失败史的患者、圆头精子症患者、解冻精子且无活动精子的患者、精子严重畸形的患者、因卵子缺乏磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸导致的卵子激活失败的患者。
本发明的第二方面提供了一种上述的用于激活icsi后未受精卵母细胞的试剂盒的应用方法，所述应用方法包括以下步骤：
1)制作激活剂工作液：将钙离子载体溶液和磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸溶液加入胚胎培养液中，混合均匀，使钙离子载体的工作浓度为5-15μm，磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸的工作浓度为5-15μm；
2)将步骤1)中配制好的激活作液加入四孔培养皿的1#孔中，将胚胎培养液加入2#、3#、4#孔中；
3)将icsi后未受精卵母细胞放入1#孔中，将四孔培养皿放在37℃，6％的二氧化碳培养箱中，培养5-10分钟；
4)从二氧化碳培养箱中取出四孔培养皿，用尖吸管将1#孔中的卵母细胞在2#孔中清洗6-8遍后，再移入3#孔中清洗6-8遍；
5)将卵母细胞转入4#孔，将四孔培养皿放入37℃，6％的二氧化碳培养箱中，培养20-30分钟；
6)重复步骤(3)、(4)，即完成激活操作，然后将卵母细胞转入胚胎培养液中培养至观察原核形成。
上述胚胎培养液为在ivf治疗中的市售人类早期胚胎培养液，作为配制卵子激活液工作液的溶剂载体，为围受精期胚胎(受精的前后24小时内的卵母细胞)提供基本的营养和生存环境。可用范围包括但不限于以下厂家的相关品牌，如vitrolife公司的g-ivf，g-ivfplus，g1以及cook公司，sage公司的相应培养液。
本发明具有如下优点：
1、本发明公开的卵母细胞的激活剂包括钙离子载体和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(pip2，英文名：l-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate)，两种组分进行复配后，协同增效，不仅对因精子缺陷导致的卵子受精激活失败有明显治疗效果，而且对因卵子缺乏pip2而导致的激活失败也有一定的治疗效果，使得卵母细胞的激活几率增加，适用范围更广。
2、本发明的激活剂中的离子霉素钙盐不仅可以将溶液中的钙离子引入细胞内，而且还可以诱导细胞内质网钙库的钙离子释放，相比于其他钙离子载体，具有激活效率更高的优点。
3、本发明优化了激活剂的操作步骤，使操作步骤更简便，在提高激活效率的同时缩短了卵母细胞和激活剂接触的时间，减少了卵母细胞的暴露风险和医务人员的工作时间。
附图说明
图1为本发明的激活方法的流程示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种用于激活icsi后未受精卵母细胞的试剂盒，包括以下组分：1)1mm的离子霉素钙盐的二甲基亚砜溶液；2)1mm的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的二甲基亚砜溶液。
该试剂盒针对挽救性卵母细胞的应用方法，包括以下步骤：
1)制作激活剂工作液：将5微升上述离子霉素钙盐溶液和5微升上述磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸溶液加入490微升胚胎培养液中，混合均匀，其中，离子霉素钙盐的工作浓度为10μm，磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸的工作浓度为10μm；
2)将500微升步骤1)中配制好的激活剂工作液加入四孔培养皿的1#孔中，分别将500微升的未添加激活剂的胚胎培养液加入2#、3#、4#孔中；
3)受精检查后，将icsi后未受精卵母细胞放入1#孔中，将四孔培养皿放在37℃，6％的二氧化碳培养箱中，培养5分钟；
4)从二氧化碳培养箱中取出四孔培养皿，用尖吸管将1#孔中的卵母细胞在2#孔中清洗3遍后，再移入3#孔中清洗3遍；
5)将卵母细胞转入4#孔，将四孔培养皿放入37℃，6％的二氧化碳培养箱中，培养20分钟；
6)重复步骤(3)、(4)，即完成激活操作，然后将卵母细胞转入胚胎培养液中培养至观察原核形成。
实施例2
一种用于激活icsi后未受精卵母细胞的试剂盒，包括以下组分：1)1mm的离子霉素的二甲基亚砜溶液；2)1mm的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的二甲基亚砜溶液。
该试剂盒针对预防性卵母细胞的应用方法，包括以下步骤：
1)制作激活剂工作液：将5微升上述离子霉素溶液和5微升上述磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸溶液加入490微升胚胎培养液中，混合均匀，其中，离子霉素的工作浓度为10μm，磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸的工作浓度为10μm；
2)将500微升步骤1)中配制好的激活剂工作液加入四孔培养皿的1#孔中，分别将500微升未添加激活剂的胚胎培养液加入2#、3#、4#孔中；
3)icsi后20-30分钟，将拟激活的卵母细胞放入1#孔中，将四孔培养皿放在37℃，6％的二氧化碳培养箱中，培养5分钟；
4)从二氧化碳培养箱中取出四孔培养皿，用尖吸管将1#孔中的卵母细胞在2#孔中清洗3遍后，再移入3#孔中清洗3遍；
5)将卵母细胞转入4#孔，将四孔培养皿放入37℃，6％的二氧化碳培养箱中，培养25分钟；
6)重复步骤(3)、(4)，即完成激活操作，然后将卵母细胞转入胚胎培养液中培养至观察原核形成。
测试例
本实施例用于说明本发明采用的激活方法对icsi受精卵的发育情况。结果见表1。
表1
其中，对照组1表示对挽救性卵母细胞未进行激活处理，对照组2表示对预防性卵母细胞未进行激活处理。
临床应用结果表明：在icsi后未受精的挽救性卵母细胞激活病例中，本发明的受精卵裂率从9.3％提高到74.65％；在icsi后未受精的预防性卵母细胞激活病例中，本发明的受精卵裂率从33.95％提高到62.79％。进一步跟踪研究表明，移植采用本发明激活方法得到的胚胎的临床妊娠率可达到44.44％，且尚未发现本发明有明显的副作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进(例如，pip2的给药方式除了在激活液中添加外，还可能添加到icsi操作液中，在进行icsi注射时随精子一起注入卵子细胞质)，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。