本发明涉及一种分析系统及方法，具体涉及一种粒子分析分析系统及方法。
背景技术：
血常规中的白细胞分析是临床区分细菌性感染和病毒感染以及感染严重度必不可少的手段，临床上常根据白细胞计数结果来指导患者用药，物理法、物理-化学法及图像分析法是目前白细胞分类计数的主要方法。虽然这几种方法下的自动计数都能够快速准确，但还存在着如下缺点：(1)分析血样少于10ul，分析时血样加入稀释剂稀释，样本量太少无法精确代表整体情况；(2)荧光染料复杂，激发光对人体有害；(3)需要待白细胞处于毛细管底部时才可以计数，计数等待时间长，速度慢；(4)计数仪器不够自动化，需要先分离出白细胞，操作繁琐；(5)虽然白细胞图像得到了显著的增强，但固定阈值算法无法分割出聚集细胞，白细胞计数误差大。
技术实现要素：
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种粒子分析系统及方法，本发明解决了粒子分析中产生的速度慢、操作繁琐、计数误差大的问题。
技术方案：一方面，本发明实施例提供一种粒子分析系统，该系统包括：
样本测试模块，包括微流控芯片，用于待血液样本与试剂充分混匀后，将混合液均匀布满所述微流控芯片的测试片；
图像采集模块，用于获取所述测试片内血液样本的数字图像并将其转为灰度图像；
图像预处理模块，用于将所述灰度图像进行粒子区域增强，并采用最大类间方差阈值法进行粒子区域粗分割，得到最佳全局阈值；
特征点构建模块，用于根据所述最佳全局阈值判断聚集粒子区域和单粒子区域，并将所述聚集粒子区域和所述单粒子区域分别进行面积峰值特征提取，并构建粒子区域面积峰值特征点集合；
识别计数模块，用于以所述粒子区域面积峰值特征点集合为输入，采用MeanShift聚类算法识别粒子区域并根据识别结果进行粒子计数。
优选的，所述判断聚集粒子区域和单粒子区域的方法为：
(1)根据所述最佳全局阈值进行阈值二值化处理图像，记细胞区域像素值为1，背景像素为0，从而得到面积连通区域；
(2)获取每个所述面积连通区域的面积，做出面积分布直方图；
(3)采用样条插值平滑拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f-1(x)，f(x)＝max f(x)，该面积即为这幅粒子图像面积判断阈值；
(4)当区域面积大于所述判断阈值A时，此区域为粒子聚集区域；若区域面积小于等于所述判断阈值A时，此区域为单粒子区域。
优选的，所述将所述聚集粒子区域进行面积峰值特征提取的方法，包括：
(1)建立所述聚集粒子区域的粒子的三维灰度图，根据所述粒子灰度曲面变化特征；
(2)采用Facet模型对所述粒子灰度曲面进行拟合、插值；
(3)获取拟合曲面8邻域峰值点的数目，从而确定聚集粒子的数目；
(4)根据所述聚集粒子区域的总面积，确定各个粒子的面积；第i个聚集区域内粒子数目Ni表示为：
Ni＝pi
其中，i为图像内第i个聚集区域，pi为第i个聚集区域内灰度三维峰值数目，此聚集粒子区域面积表示为：
其中，Ai为图像内第i个聚集粒子区域的面积，Ni为第i个聚集粒子区域内粒子数目，A(i,k)则为第i个区域内第k个粒子面积，则此粒子区域灰度最大值处即为粒子峰值P(i,k)；
所述单粒子区域进行面积峰值特征提取时，所述单粒子面积As等于单粒子区域面积，粒子对应峰值Ps特征等于单粒子区域8邻居最大值。
优选的，所述构建粒子区域面积峰值特征点集合，具体为：
所述集合F为：
F＝{As,Am；Ps,Pm}
其中，As为各单一粒子面积集，Am为聚集区域各粒子面积集，Ps为各单一粒子峰值集，Pm为聚集区域各粒子峰值集。
优选的，所述采用MeanShift聚类算法识别粒子区域并进行计数，具体包括：
以所述粒子区域面积峰值特征点集合F为输入，x为集合中一点，则MeanShift函数表示为：
Mh(x)＝mh(x)-x
其中，
G(x)为高斯核函数，h为核函数带宽，ω为权重函数；首先选择像素x为种子点，ε为容许误差，所述MeanShift算法步骤如下：
(1)初始化数据，随机选取初始节点x开始计算mh(x)，将mh(x)赋给x；
(2)确定移动步长h，计算下一节点mh(x)；
(3)若||mh(x)-x||<ε，则标记该节点并将从起始点开始所有经过的节点赋予该标记过节点相同的标记，迭代停止；
(4)若‖mh(x)-x‖≥ε，继续执行步骤(1)和(2)，直到所有节点都被标记；
(5)合并同质区，完成聚类粒子识别；
根据所述聚类粒子识别结果定义粒子区域，所述粒子区域集合元素数量即为粒子数目。
另一方面，本发明实施例还提供了一种粒子分析方法，所述方法包括以下步骤：
(1)待血液样本与试剂充分混匀后，将混合液均匀布满微流控芯片的测试片中；
(2)获取所述测试片内血液样本的数字图像并将其转为灰度图像；
(3)将所述灰度图像进行粒子区域增强，并采用最大类间方差阈值法进行粒子区域粗分割，得到最佳全局阈值；
(4)根据所述最佳全局阈值判断聚集粒子区域和单粒子区域，并将所述聚集粒子区域和所述单粒子区域分别进行面积峰值特征提取，并构建粒子区域面积峰值特征点集合；
(5)以所述粒子区域面积峰值特征点集合为输入，采用MeanShift聚类算法识别粒子区域并根据识别结果进行粒子计数。
优选的，步骤(4)中，所述判断聚集粒子区域和单粒子区域的方法为：
(1)根据所述最佳全局阈值进行阈值二值化处理图像，记细胞区域像素值为1，背景像素为0，从而得到面积连通区域；
(2)获取每个所述面积连通区域的面积，做出面积分布直方图；
(3)采用样条插值平滑拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f-1(x)，f(x)＝max f(x)，该面积即为这幅粒子图像面积判断阈值；
(4)当区域面积大于所述判断阈值A时，此区域为粒子聚集区域；若区域面积小于等于所述判断阈值A时，此区域为单粒子区域。
优选的，步骤(4)中，所述将所述聚集粒子区域进行面积峰值特征提取的方法，包括：
(1)建立所述聚集粒子区域的粒子的三维灰度图，根据所述粒子灰度曲面变化特征；(2)采用Facet模型对所述粒子灰度曲面进行拟合、插值；
(3)获取拟合曲面8邻域峰值点的数目，从而确定聚集粒子的数目；
(4)根据所述聚集粒子区域的总面积，确定各个粒子的面积；第i个聚集区域内粒子数目Ni为：
Ni＝pi
其中，i为图像内第i个聚集区域，pi为第i个聚集区域内灰度三维峰值数目，此聚集区域粒子面积为：
其中，Ai为图像内第i个聚集粒子区域的面积，Ni为第i个聚集粒子区域内粒子数目，A(i,k)则为第i个区域内第k个粒子面积，则此粒子区域灰度最大值处即为粒子峰值P(i,k)；
所述单粒子区域进行面积峰值特征提取时所述单粒子面积As等于单粒子区域面积，粒子对应峰值Ps特征等于单粒子区域8邻居最大值。
优选的，步骤(4)中，所述构建粒子区域面积峰值特征点集合，具体包括：
所述集合F为：
F＝{As,Am；Ps,Pm}
其中，As为各单一粒子面积集，Am为聚集区域各粒子面积集，Ps为各单一粒子峰值集，Pm为聚集区域各粒子峰值集。
优选的，步骤(5)中，所述采用MeanShift聚类算法识别粒子区域并进行计数，具体包括：
以所述粒子区域面积峰值特征点集合F为输入，x为集合中一点，则MeanShift函数表示为：
Mh(x)＝mh(x)-x
其中，
G(x)为高斯核函数，h为核函数带宽，ω为权重函数，xi为第i个聚集区域内的其他粒子；首先选择像素x为种子点，ε为容许误差，所述MeanShift算法步骤如下：
(1)初始化数据，随机选取初始节点x开始计算mh(x)，将mh(x)赋给x；
(2)确定移动步长h，计算下一节点mh(x)；
(3)若‖mh(x)-x‖<ε，则标记该节点并将从起始点开始所有经过的节点赋予该标记过节点相同的标记，迭代停止；
(4)若‖mh(x)-x‖≥ε，继续执行步骤(1)和(2)，直到所有节点都被标记；
(5)合并同质区，完成聚类粒子识别；
根据所述聚类粒子识别结果定义粒子区域，所述粒子区域集合元素数量即为粒子数目。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：1、本发明采用基于生物试剂的白细胞图像获取方法，去除红细胞干扰，快速获取更加精确的白细胞显微镜图像；2、本发明的图像区域增强、粒子区域分割、ROI区域特征构建、无监督粒子识别，不仅可以快速识别出区域及链码特征不明显的聚集粒子，还能够精确去除样本内杂质干扰，粒子计数分析更加准确、可靠。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的粒子分析系统结构示意图；
图2为本发明一实施例提供的粒子分析方法流程图；
图3为本发明一实施例提供的白细胞采集图像；
图4为本发明一实施例提供的白细胞粗分割图像；
图5为本发明一实施例提供的判断聚集粒子区域和单粒子区域的方法流程图；
图6为本发明一实施例提供的粒子面积直方图及拟合曲线图；
图7为本发明一实施例提供的白细胞二维曲面拟合图；
图8为本发明一实施例提供的白细胞三维曲面拟合图；
图9为本发明一实施例提供的杂质多样本图像；
图10为本发明一实施例提供的杂质粒子面积散点及MeanShift分类结果图；
图11为本发明一实施例提供的正常样本粒子面积散点及MeanShift分类结果图；
图12为本发明一实施例提供的本方法与血细胞分析仪测量结果相关系数曲线图；
图13为本发明一实施例提供的细胞分析仪装置的整体结构示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例以白细胞作为研究对象，一方面，本发明实施例提供一种粒子分析系统，该系统包括，如图1所示：
样本测试模块，包括微流控芯片，用于待血液样本与试剂充分混匀后，将混合液均匀布满微流控芯片的测试片。
采用实验血样样本品10μl，该样本来源于医院检验科，加入装有试剂的容器中与试剂混合均匀。试剂由溶血剂，染色剂构成，干燥状态存储在试剂微管内。溶血剂用于裂解血液样本中红细胞，减少红细胞干扰，简化样本中白血细胞的区分和鉴定；染色剂用于对白细胞染色，加强白细胞与杂质背景的差异，提高后续检测精度。待血液样本与试剂充分混匀后，由移液枪加入测试片加样槽，混合液会在毛细作用下均匀布满测试片内腔。
图像采集模块，用于获取测试片内血液样本的数字图像并将其转为灰度图像，所获取的图像有效像素不低于2M，本实施例图像大小为1920×1080。
优选的，可以采用照明单元打开，照射测试片。图像传感器初始化配置和动态设置，软件发送指令由CCD或CMOS对经过光学显微镜单元放大的样本数据进行实时采集、ISP处理及图像自动曝光，获取自动调整的高质量数字图像作为后面的模块的输入数据。照明单元为LED照明，LED上面配有一个均光片，以保证光强的均匀分布；光学显微镜单元的光学放大率为1.5-10倍，优选4倍，透镜原件<3片，以保证被染色的白细胞于图像上清晰可见。
图像预处理模块，用于将上述步骤得到灰度图像首先进行粒子区域增强。
采集过程中受处理器、灯光及溶液杂质等影响，获取的图像往往背景不均匀，为后期粒子计数带来干扰。结合便携式设备图像特点，首先采用半径为20的圆形结构元素对图像进行开运算重构，再从原图中减去开运算重构结果，即可实现粒子区域增强。即：
Inew＝I0-Iopen
其中，Inew为粒子增强图像，I0为获取到的粒子图像的B分量图像，Iopen为经半径20圆形结构元素开运算重构后图像。获取到的粒子图像为RGB图像，白细胞染色后呈蓝色，本发明中提取RGB图像的B分量用于粒子识别计数。
其次，采用最大类间方差阈值法进行粒子区域粗分割，得到最佳全局阈值T'。
图像经开运算重构后，粒子区域得到显著增强，简单的阈值就可以实现粒子区域分割。为避免不同机器间图像对比度差异，考虑到分割部分运行速度，粒子区域分割采用最大类间方差阈值法实现。
最大类间方差法根据图像的灰度特性，将图像分为前景和背景两个部分。当构成图像的两个部分之间的差别越大时，则二者间方差差异越大；当目标被错分时，则二者间方差差异变小。通过对比前景和背景之间的类间方差，便可得到最佳全局阈值T'。粒子分割也可以应用其它二分类算法。
具体步骤包括：
步骤1、在满足图像灰度范围的前提下，在图像灰度区间初始化阈值T；
步骤2、使用T分割图像fi'，将其大小记为M×N，将图像中像素的灰度值大于等于T的像素区域记作g1，小于T的区域记作g2；
计算g1和g2区域内的灰度方差u1和u2；
步骤3、更新阈值T：
步骤4、计算类间方差σ：
σ＝ω1×ω2×(μ1-μ2)2
其中，ω1为区域g1的面积占降噪图像面积比，ω2为区域g2的面积占整幅图像面积比，并且ω1+ω2＝1。
步骤5、重复过程步骤(2)-(4)，直到连续迭代中T的使得σ最小为止，得到最佳分类阈值T'，从而实现白细胞区域分割。
特征点构建模块，用于根据上述图像预处理模块得到的最佳全局阈值判断聚集粒子区域和单粒子区域。
虽然血液样本内红细胞被溶血剂溶解掉，但对于一些高血脂等样本，还会存在一些未能完全溶解的其它成分，在图像上表现为杂质，干扰白细胞正常计数。与细胞区域相比，杂质区域灰度略浅；图像自动阈值处理后，杂质区域面积略小。这一特征使得杂质与细胞的面积-峰值散点图上表现为不同聚类区间。基于此，本模块提取ROI区域面积及其区域灰度峰值，构建特征散点图，最后通过聚类的方法，获取面积-峰值散点图上白细胞散点聚类区间，精确评估粒子浓度。
正常情况下，粒子均匀的分布在图像上。随着粒子数量的增多，或前期化学药物没有混匀时，则图像会出现粒子分布不均、粒子聚集的现象。为了获取高精度的特征点，本模块首先构建粒子面积判别函数，对非聚集和聚集粒子分别提取对应的相关特征。粒子区域判别步骤如下：
首先，采用自适应阈值法得到的最佳分类阈值T'，进行二值化处理图像，此时细胞区域像素值为1，背景像素为0，得到面积连通区域；
其次，获取每个连通区域面积，计算面积分布；
最后，样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f-1(x)，f(x)＝max f(x)。此面积即为这幅图像面积判断阈值。
当区域面积大于判断阈值A时，此区域为聚集区域；反之则为单粒子区域。图5为粒子面积直方图及拟合曲线。虚线处所对应面积，即为面积判断阈值A。这里所涉及的拟合为样条插值平滑拟合，拟合参数为经验值0.003。
将聚集粒子区域和单粒子区域分别进行面积峰值特征提取，当区域面积小于判断阈值A时，此区域为单粒子区域。此时粒子面积As等于单粒子区域面积，粒子对应峰值Ps特征等于单粒子区域8邻居最大值。
当图像中粒子数目增多时，粒子会出现明显的聚集现象。针对聚集区域粒子，首先通过识别粒子的三维灰度图，获取峰值数，来确定聚集粒子数目；然后根据聚集区域总面积，来确定各粒子面积。为了避免过低的放大倍数引起的粒子三维曲面粗糙情况，算法首先根据粒子灰度曲面变化特征，采用Facet模型对粒子曲面进行拟合、插值；再获取拟合曲面8邻域峰值点。细胞曲面拟合也可以采用其它拟合方法。第i个聚集区域内粒子数目Ni为：
Ni＝pi
其中，i为图像内第i个聚集区域，pi为第i个聚集局域内灰度三维峰值数目。则此聚集区域粒子面积为：
其中，Ai为图像内第i个聚集区域面积，Ni为第i个聚集局域内粒子数目，A(i,k)则为第i个区域内第k个粒子面积，则此粒子区域灰度最大值处即为粒子峰值P(i,k)。
粒子区域特征点集合F为：
F＝{As,Am；Ps,Pm}
其中，As为各单一粒子面积集，Am为聚集区域各粒子面积集，Ps为各单一粒子峰值集，Pm为聚集区域各粒子峰值集。
识别计数模块，用于以所述粒子区域面积峰值特征点集合为输入，采用MeanShift聚类算法识别粒子区域并根据识别结果进行粒子计数。
由于血液样本的不确定性及复杂性，并不是每个样本图像都含有大量杂质，即粒子面积-峰值散点聚集区间存在不确定性，最后得到的特征点集合F也有一定的不确定性，可能存在一些杂质，有些杂质无法用化学方法提取出来并且有些化学方法成本是比较高的，在此基础上，选取MeanShift聚类实现粒子区域聚类识别，可以更精确的得到识别结果，并且抗干扰能力较强。MeanShift聚类算法即均值漂移算法，这是一种基于核密度估计的爬山算法，可用于聚类、图像分割、跟踪等。本发明首次将此聚类算法应用到白细胞分析中，它的工作原理基于质心，以定位每个簇/类的质心为目标，首先算出当前点的偏移均值，将该点移动到此偏移均值，然后以此为新的起始点，继续移动，直到满足最终的条件，找出最密集的区域。与其它聚类算法相比，MeanShift不需要实现定义聚类数量，算法推动聚类中心在向密度最大区域靠近的效果也很好，非常适合无确定类别粒子数据分类。
MeanShift聚类方法如下：
特征集合为F＝{As,Am；Ps,Pm}，若x为集合中一点，则MeanShift函数表示为：
Mh(x)＝mh(x)-x
其中：
G(x)为核函数，h为核函数带宽，ω为权重函数，xi为第i个聚集区域内的其他粒子。选择像素x为种子点，ε为容许误差，MeanShift算法步骤如下：
①初始化数据，随机选取初始节点x开始计算mh(x)，将mh(x)赋给x；
②确定移动步长h，计算下一节点mh(x)；
③若||mh(x)-x||<ε，则标记该节点并将从起始点开始所有经过的节点赋予该标记过节点相同的标记，迭代停止；
④若||mh(x)-x||≥ε，继续执行①，②，直到所有节点都被标记；
⑤合并同质区，完成聚类粒子识别。
本算法中容许误差ε迭代阈值为经验值，为0.1；G(x)为高斯核函数，移动步长h为19个像素点；定义峰值为60、面积为50所在类为粒子区域为Mci，则Mci集合内元素数量即为此样本粒子数目。
获取到粒子数量后，获取粒子浓度L可通过如下公式：
其中，Ncell为MeanShift聚类获取的粒子数目，ω为光学放大倍数，A为图像像素个数，H为微流控芯片高度，M为图像每像素实际长度。
当白血细胞数量超过20×109细胞/升血液时，上述算法无法精确获取聚集细胞数目，产生误差。这种误差是由粒子间重复堆积引起的，目前没有有效的算法将其消除，且随着待测量细胞增加而增大。当白血细胞数量在20×109细胞/升血液以上时，将启动统计修正来修正粒子浓度值。粒子浓度的统计修正通过与测量仪器校准的方式来测定。用于校准的测量仪器为使用库尔特原理的血细胞分析仪。
另一方面，本发明实施例还提供了一种粒子分析方法，如图2所示，该方法包括：
S01待血液样本与试剂充分混匀后，将混合液均匀布满微流控芯片的测试片中。
采用实验血样样本品10μl，该样本来源于医院检验科，加入装有试剂的容器中与试剂混合均匀。试剂由溶血剂，染色剂构成，干燥状态存储在试剂微管内。溶血剂用于裂解血液样本中红细胞，减少红细胞干扰，简化样本中白血细胞的区分和鉴定；染色剂用于对白细胞染色，加强白细胞与杂质背景的差异，提高后续检测精度。待血液样本与试剂充分混匀后，由移液枪加入测试片加样槽，混合液会在毛细作用下均匀布满测试片内腔。
图像采集模块，用于获取测试片内血液样本的数字图像并将其转为灰度图像，所获取的图像有效像素不低于2M，本实施例图像大小为1920×1080。
S02获取所述测试片内血液样本的数字图像并将其转为灰度图像。
如图3所示，所获取的图像有效像素不低于2M。
优选的，可以采用照明单元打开，照射测试片。图像传感器初始化配置和动态设置，软件发送指令由CCD或CMOS对经过光学显微镜单元放大的样本数据进行实时采集、ISP处理及图像自动曝光，获取自动调整的高质量数字图像作为后面的模块的输入数据。照明单元为LED照明，LED上面配有一个均光片，以保证光强的均匀分布；光学显微镜单元的光学放大率为1.5-10倍，优选4倍，透镜原件<3片，以保证被染色的白细胞于图像上清晰可见。
S03将灰度图像进行粒子区域增强，然后采用最大类间方差阈值法进行粒子区域粗分割，得到最佳全局阈值。
采集过程中受处理器、灯光及溶液杂质等影响，获取的图像往往背景不均匀，为后期粒子计数带来干扰。结合便携式设备图像特点，首先采用半径为20的圆形结构元素对图像进行开运算重构，再从原图中减去开运算重构结果，即可实现粒子区域增强。即：
Inew＝I0-Iopen
其中，Inew为粒子增强图像，I0为获取到的粒子图像的B分量图像，Iopen为经半径20圆形结构元素开运算重构后图像。获取到的粒子图像为RGB图像，白细胞染色后呈蓝色，本发明中提取RGB图像的B分量用于粒子识别计数。
图像经开运算重构后，粒子区域得到显著增强，简单的阈值就可以实现粒子区域分割。为避免不同机器间图像对比度差异，考虑到分割部分运行速度，粒子区域分割采用最大类间方差阈值法实现。
最大类间方差法根据图像的灰度特性，将图像分为前景和背景两个部分。当构成图像的两个部分之间的差别越大时，则二者间方差差异越大；当目标被错分时，则二者间方差差异变小。通过对比前景和背景之间的类间方差，便可得到最佳全局阈值。粒子分割也可以应用其它二分类算法。
具体步骤包括：
步骤1、在满足图像灰度范围的前提下，在图像灰度区间初始化阈值T；
步骤2、使用T分割图像fi'，将其大小记为M×N，将图像中像素的灰度值大于等于T的像素区域记作g1，小于T的区域记作g2；
计算g1和g2区域内的灰度方差u1和u2；
步骤3、更新阈值T：
步骤4、计算类间方差σ：
σ＝ω1×ω2×(μ1-μ2)2
其中，ω1为区域g1的面积占降噪图像面积比，ω2为区域g2的面积占整幅图像面积比，并且ω1+ω2＝1。
步骤5、重复过程步骤(2)-(4)，直到连续迭代中T的使得σ最小为止，得到最佳分类阈值T'，从而实现白细胞区域分割，如图4所示。
S04根据所述最佳全局阈值判断聚集粒子区域和单粒子区域，如图5所示；将所述聚集粒子区域和所述单粒子区域分别进行面积峰值特征提取，如图6所示；并构建粒子区域面积峰值特征点集合。
虽然血液样本内红细胞被溶血剂溶解掉，但对于一些高血脂等样本，还会存在一些未能完全溶解的其它成分，在图像上表现为杂质，干扰白细胞正常计数。与细胞区域相比，杂质区域灰度略浅；图像自动阈值处理后，杂质区域面积略小。这一特征使得杂质与细胞的面积-峰值散点图上表现为不同聚类区间。基于此，本模块提取ROI区域面积及其区域灰度峰值，构建特征散点图，最后通过聚类的方法，获取面积-峰值散点图上白细胞散点聚类区间，精确评估粒子浓度。
正常情况下，粒子均匀的分布在图像上。随着粒子数量的增多，或前期化学药物没有混匀时，则图像会出现粒子分布不均、粒子聚集的现象。为了获取高精度的特征点，本模块首先构建粒子面积判别函数，对非聚集和聚集粒子分别提取对应的相关特征。粒子区域判别步骤如下：
首先，采用自适应阈值法得到的最佳分类阈值T'，进行二值化处理图像，此时细胞区域像素值为1，背景像素为0，得到面积连通区域；
其次，获取每个连通区域面积，计算面积分布；
最后，样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f-1(x)，f(x)＝max f(x)。此面积即为这幅图像面积判断阈值。
当区域面积大于判断阈值A时，此区域为聚集区域；反之则为单粒子区域。图5为粒子面积直方图及拟合曲线。虚线处所对应面积，即为面积判断阈值A。这里所涉及的拟合为样条插值平滑拟合，拟合参数为经验值0.003。
将聚集粒子区域和单粒子区域分别进行面积峰值特征提取，当区域面积小于判断阈值A时，此区域为单粒子区域。此时粒子面积As等于单粒子区域面积，粒子对应峰值Ps特征等于单粒子区域8邻居最大值。
当图像中粒子数目增多时，粒子会出现明显的聚集现象。针对聚集区域粒子，首先通过识别粒子的三维灰度图，获取峰值数，来确定聚集粒子数目；然后根据聚集区域总面积，来确定各粒子面积。为了避免过低的放大倍数引起的粒子三维曲面粗糙情况，算法首先根据粒子灰度曲面变化特征，采用Facet模型对粒子曲面进行拟合、插值；再获取拟合曲面8邻域峰值点，如图7和图8所示。细胞曲面拟合也可以采用其它拟合方法。第i个聚集区域内粒子数目Ni为：
Ni＝pi
其中，i为图像内第i个聚集区域，pi为第i个聚集局域内灰度三维峰值数目。则此聚集区域粒子面积为：
其中，Ai为图像内第i个聚集区域面积，Ni为第i个聚集局域内粒子数目，A(i,k)则为第i个区域内第k个粒子面积，则此粒子区域灰度最大值处即为粒子峰值P(i,k)。
粒子区域特征点集合F为：
F＝{As,Am；Ps,Pm}
其中，As为各单一粒子面积集，Am为聚集区域各粒子面积集，Ps为各单一粒子峰值集，Pm为聚集区域各粒子峰值集。
S05以所述粒子区域面积峰值特征点集合为输入，采用MeanShift聚类算法识别粒子区域并根据识别结果进行粒子计数。
由于血液样本的不确定性及复杂性，并不是每个样本图像都含有大量杂质，即粒子面积-峰值散点聚集区间存在不确定性。根据这一特性，选取MeanShift聚类实现粒子区域聚类识别。MeanShift聚类算法即均值漂移算法，这是一种基于核密度估计的爬山算法，可用于聚类、图像分割、跟踪等。它的工作原理是基于质心，以定位每个簇/类的质心为目标，首先算出当前点的偏移均值，将该点移动到此偏移均值，然后以此为新的起始点，继续移动，直到满足最终的条件(找出最密集的区域)。与其它聚类算法相比，Mean-Shift不需要实现定义聚类数量，算法推动聚类中心在向密度最大区域靠近的效果也很好，非常适合无确定类别粒子数据分类。
MeanShift聚类原理如下：
特征集合为F＝{As,Am；Ps,Pm}，若x为集合中一点，则MeanShift函数表示为：
Mh(x)＝mh(x)-x
其中：
G(x)为核函数，h为核函数带宽，ω为权重函数，xi为第i个聚集区域内的其他粒子。选择像素x为种子点，ε为容许误差，MeanShift算法步骤如下：
初始化数据，随机选取初始节点x开始计算mh(x)，将mh(x)赋给x；
确定移动步长h，计算下一节点mh(x)；
若||mh(x)-x||<ε，则标记该节点并将从起始点开始所有经过的节点赋予该标记过节点相同的标记，迭代停止；
若||mh(x)-x||≥ε，继续执行①，②，直到所有节点都被标记；
合并同质区，完成聚类粒子识别。
如图9为含有杂质的多样本图像，含杂质样本与不含杂质样本聚类结果如图10，图11所示，圆圈区域为杂质区域，黑色点为粒子区域。图10为无杂质样本MeanShift聚类结果，为1类，图11为杂质样本聚类结果，为2类，即下方杂质区域及上方粒子区域。容许误差ε迭代阈值为经验值，为0.1；G(x)为高斯核函数，移动步长h为19个像素点；定义峰值为60、面积为50所在类为粒子区域为Mci，则Mci集合内元素数量即为此样本粒子数目。通过分析低倍显微镜下白细胞区域像素属性，构建粒子面积-峰值散点图，MeanShift无监督自动聚类识别的粒子区域并计数，避免粒子聚集、样本杂质等引起的计数误差，粒子计数更加准确。
获取到粒子数量后，粒子浓度L可通过如下公式获取：
其中，Ncell为MeanShift聚类获取的粒子数目，ω为光学放大倍数，A为图像像素个数，H为微流控芯片高度，M为图像每像素实际长度。
当白血细胞数量超过20×109细胞/升血液时，上述算法无法精确获取聚集细胞数目，产生误差。这种误差是由粒子间重复堆积引起的，目前没有有效的算法将其消除，且随着待测量细胞增加而增大。当白血细胞数量在20×109细胞/升血液以上时，将启动统计修正来修正粒子浓度值。粒子浓度的统计修正通过与测量仪器校准的方式来测定。用于校准的测量仪器为使用库尔特原理的血细胞分析仪。
经过实验，此粒子分析系统和方法的技术结果为5.65，而普通方法计数结果为6.1；图12为本方法与迈瑞BC5140生化分析仪测量结果相关系数曲线，R2＝0.9986。从初步实验效果图来看，本方法性能良好，较便捷、准确的实现白细胞准确计数。
实施例2
本发明还提供另外一个实施例，该实施例是以名称为一种血细胞分析仪进样装置为基础，申请号为2017112339706。
如图13所示，该装置包含半自动进样单元1，照明单元2，光学显微单元3，图像获取单元4，图像处理单元5和结果显示单元6；照明单元2为LED照明方式，LED上配备匀光片以保证光强的均匀分布；光学显微单元3的光学放大率为1.5～10倍，透镜元件<3片；图像获取单元4为CCD或CMOS；有效像素不低于2M；图像处理单元5包括图像区域增强、粒子区域分割、ROI区域特征点构建、粒子无监督聚类识别计数及浓度修正；结果显示单元6为LED显示屏，用于对图像处理单元5计数结果进行显示。
利用该分析仪进行白细胞计数，更加快速、准确、便捷，首先进行样本准备，一次性毛细血管吸取病人指尖血10μl，加入装有试剂的容器中与试剂混合均匀。试剂由溶血剂，染色剂构成，干燥状态存储在试剂微管内。溶血剂用于裂解血液样本中红细胞，减少红细胞干扰，简化样本中白血细胞的区分和鉴定；染色剂用于对白细胞染色，加强白细胞与杂质背景的差异，提高后续检测精度。待血液样本与试剂充分混匀后，由移液枪加入测试片加样槽，混合液会在毛细作用下均匀布满测试片内腔。
接着，图像获取；将装有血液样本的测试片放置在进样单元内并推入装置，照明单元打开，照射测试片。图像传感器初始化配置和动态设置，软件发送指令由CCD或CMOS对经过光学显微镜单元放大的样本数据进行实时采集、ISP处理及图像自动曝光，获取自动调整的高质量数字图像作为后面的算法模块的输入数据。其中，进样单元为半自动进样；照明单元为LED照明，LED上面配有一个均光片，以保证光强的均匀分布；光学显微镜单元的光学放大率为1.5-10倍，优选4倍，透镜原件<3片，以保证被染色的白细胞于图像上清晰可见；图像传感器采集图像过程由图像获取单元4内完成，所获取的图像有效像素不低于2M。
其次，图像处理和粒子计数；图像获取单元4获取到粒子图像后，将图像送至图像处理单元进行粒子分析计数。图像处理单元主要包括：粒子区域增强、粒子区域分割、ROI区域特征点构建、粒子识别计数及浓度修正。
(1)粒子区域增强
采集过程中受处理器、灯光及溶液杂质等影响，获取的图像往往背景不均匀，为后期粒子计数带来干扰。结合便携式设备图像特点，图像处理单元首先采用半径为20的圆形结构元素对图像进行开运算重构，再从原图中减去开运算重构结果，即可实现粒子区域增强。即：
Inew＝I0-Iopen
其中，Inew为粒子增强图像，I0为图像获取单元4获取到的粒子图像的B分量图像，Iopen为经半径20圆形结构元素开运算重构后图像。从图像获取单元获取到的粒子图像为RGB图像，白细胞染色后呈蓝色，故本发明提取RGB图像的B分量用于粒子识别计数。
(2)粒子区域分割
图像经开运算重构后，粒子区域得到显著增强，简单的阈值就可以实现粒子区域分割。为避免不同机器间图像对比度差异，考虑到分割部分运行速度，粒子区域分割采用最大类间方差阈值法实现。
最大类间方差法根据图像的灰度特性，将图像分为前景和背景两个部分。当构成图像的两个部分之间的差别越大时，则二者间方差差异越大；当目标被错分时，则二者间方差差异变小。通过对比前景和背景之间的类间方差，便可得到最佳全局阈值。粒子分割也可以应用其它二分类算法。
(3)ROI区域特征点构建
虽然血液样本内红细胞被溶血剂溶解掉，但对于一些高血脂等样本，还会存在一些未能完全溶解的其它成分，在图像上表现为杂质，干扰白细胞正常计数。与细胞区域相比，杂质区域灰度略浅；图像自动阈值处理后，杂质区域面积略小。这一特征使得杂质与细胞的面积-峰值散点图上表现为不同聚类区间。基于此，本模块提取ROI区域面积及其区域灰度峰值，构建特征散点图，最后通过聚类的方法，获取面积-峰值散点图上白细胞散点聚类区间，精确评估粒子浓度。
①聚集粒子区域判断
正常情况下，粒子均匀的分布在图像上。随着粒子数量的增多，或前期化学药物没有混匀时，则图像会出现粒子分布不均、粒子聚集的现象。为了获取高精度的特征点，本模块首先构建粒子面积判别函数，对非聚集和聚集粒子分别提取对应的相关特征。粒子区域判别步骤如下：
首先，采用自适应阈值法得到的得到最佳分类阈值，进行二值化处理图像，此时细胞区域像素值为1，背景像素为0，得到面积连通区域；
其次，获取每个连通区域面积，计算面积分布；
最后，样条插值拟合直方图曲线f(x)，获取第一个峰值对应面积，即：A＝f-1(x)，f(x)＝max f(x)。此面积即为这幅图像面积判断阈值。
当区域面积大于判断阈值A时，此区域为聚集区域；反之则为单粒子区域。图5为粒子面积直方图及拟合曲线。虚线处所对应面积，即为面积判断阈值A。这里所涉及的拟合为样条插值平滑拟合，拟合参数为经验值0.003。
②单粒子区域面积峰值特征提取
当区域面积小于判断阈值A时，此区域为单粒子区域。此时粒子面积As等于单粒子区域面积，粒子对应峰值Ps特征等于单粒子区域8邻居最大值。
③聚集粒子区域面积峰值特征提取
当图像中粒子数目增多时，粒子会出现明显的聚集现象。针对聚集区域粒子，图像处理单元5首先通过识别粒子的三维灰度图，获取峰值数，来确定聚集粒子数目；然后根据聚集区域总面积，来确定各粒子面积。为了避免过低的放大倍数引起的粒子三维曲面粗糙情况，算法首先根据粒子灰度曲面变化特征，采用Facet模型对粒子曲面进行拟合、插值；再获取拟合曲面8邻域峰值点。细胞曲面拟合也可以采用其它拟合方法。第i个聚集区域内粒子数目Ni为：
Ni＝pi
其中，i为图像内第i个聚集区域，pi为第i个聚集局域内灰度三维峰值数目。则此聚集区域粒子面积为：
其中，Ai为图像内第i个聚集区域面积，Ni为第i个聚集局域内粒子数目，A(i,k)则为第i个区域内第k个粒子面积，则此粒子区域灰度最大值处即为粒子峰值P(i,k)。
④粒子区域面积峰值特征点构建
粒子区域特征点集合F为：
F＝{As,Am；Ps,Pm}
其中，As为各单一粒子面积集，Am为聚集区域各粒子面积集，Ps为各单一粒子峰值集，Pm为聚集区域各粒子峰值集。
(4)粒子识别计数
由于血液样本的不确定性及复杂性，并不是每个样本图像都含有大量杂质，即粒子面积-峰值散点聚集区间存在不确定性。根据这一特性，选取MeanShift聚类实现粒子区域聚类识别。MeanShift聚类算法即均值漂移算法，这是一种基于核密度估计的爬山算法，可用于聚类、图像分割、跟踪等。它的工作原理基于质心，以定位每个簇/类的质心为目标，首先算出当前点的偏移均值，将该点移动到此偏移均值，然后以此为新的起始点，继续移动，直到满足最终的条件，找出最密集的区域。与其它聚类算法相比，Mean-Shift不需要实现定义聚类数量，算法推动聚类中心在向密度最大区域靠近的效果也很好，非常适合无确定类别粒子数据分类。
MeanShift聚类原理如下：
设特征集合为X，x为集合中一点，则MeanShift函数表示为：
Mh(x)＝mh(x)-x
其中：
G(x)为核函数，h为核函数带宽，ω为权重函数。选择像素x为种子点，ε为容许误差，MeanShift算法步骤如下：
步骤1、初始化数据，随机选取初始节点x开始计算mh(x)，将mh(x)赋给x；
步骤2、确定移动步长h，计算下一节点mh(x)；
步骤3、若||mh(x)-x||<ε，则标记该节点并将从起始点开始所有经过的节点赋予该标
记过节点相同的标记，迭代停止；
步骤4、若||mh(x)-x||≥ε，继续执行①，②，直到所有节点都被标记；
步骤5、合并同质区，完成聚类粒子识别。
(5)粒子浓度计算及修正
获取到粒子数量后，粒子浓度L可通过如下公式获取：
其中，Ncell为MeanShift聚类获取的粒子数目，ω为光学放大倍数，A为图像像素个数，H为微流控芯片高度，M为图像每像素实际长度。
当白血细胞数量超过20×109细胞/升血液时，上述算法无法精确获取聚集细胞数目，产生误差。这种误差是由粒子间重复堆积引起的，目前没有有效的算法将其消除，且随着待测量细胞增加而增大。当白血细胞数量在20×109细胞/升血液以上时，图像处理单元5将启动统计修正来修正粒子浓度值。粒子浓度的统计修正通过与测量仪器校准的方式来测定。用于校准的测量仪器为使用库尔特原理的血细胞分析仪。
本发明结合生化技术，光学显微镜成像技术、图像无监督识别及统计学修正，对基于图像的便携式粒子数量进行精确的计数，弥补了现有便携式产品的不足，促进便携式检验设备的数字化进程，并为以后的白细胞检测和便携式检验设备的打下基础。