本发明涉及一种用于同时记录总图并用于确定荧光染料浓度的空间分布的近似值的显微镜系统。
背景技术
荧光染料在肿瘤切除的领域中用于区分患病组织与健康组织。为此在患病组织的区域中富集荧光染料，当用其激发谱中的光对其进行照射时，该荧光染料发射其发射谱中的荧光。因为荧光仅仅由已经富集了荧光染料的组织发出，额外的总图是有用的，以便能够观察到被健康组织包围的患病组织。
然而，由组织发射的荧光不是对荧光染料浓度的度量并且因此不是对患病组织的量/浓度的度量，因为荧光的强度还取决于组织的其他特性。存在相同浓度的荧光染料的组织区域因而在荧光图像中显示为具有不同强度，即使在这些区域中荧光染料的浓度相同。组织的以下特性造成在由荧光染料发射的强度和到达检测器的强度之间的差异。一方面，组织在激发谱的范围内吸收光，使得实际上并不是所有预期用于激发荧光染料的光都到达荧光染料。在发射的波长范围内，荧光的光散射导致并不是所有由荧光染料发射的光都到达检测器，而是被周围的组织散射。
已经显示出，存在对实际上由荧光染料发射的光强度的半经验近似，该近似取决于所测量的荧光强度和在吸收谱和发射谱的波长范围内的反射光强度(p.a.valdés等人，“aspectrallyconstraineddual-bandnormalizationtechniqueforprotoporphyrinixquantificationinfluorescence-guidedsurgery(用于在荧光指导的手术中的原卟啉ix定量的光谱受限式双带归一化技术)”，opticalsocietyofamerica,opticsletter，第37卷，第11期，2012年6月1日，1817-1819)。
归纳式的近似可以如下地表述：
其中
iko1表示位于荧光染料的发射谱附近的波长范围内由组织反射的光的强度的空间分布，
iko2表示位于荧光染料的激发谱附近的波长范围内由组织反射的光的强度的空间分布，
a表示经验参数，
α表示其他的经验参数，并且
β表示再另一个经验参数。
参数a、α和β可以例如借助于类似的方法以经验方式确定。光强度的空间分布
被配置为检测
技术实现要素：
因此本发明的一个目的是提供克服此缺点的显微镜系统。本发明的目的尤其是提供一种能够重复且快速检测荧光染料浓度的空间分布的显微镜系统。
上述目的通过本发明的显微镜系统实现，该显微镜系统被配置为同时记录强度分布
一种根据本发明的用于同时记录总图并确定在目标区域中的组织中的荧光染料浓度的显微镜系统包括：检测器系统，被配置为：在第一检测区域内检测第一通道的光并将其转换成第一荧光信号，在第二检测区域内检测第二通道的光并将其转换成第一修正信号，以及在第三检测区域内检测第三通道的光并将其转换成第二修正信号，其中(基本上排他地)在该第一检测区域(第一通道)中检测该荧光染料的发射谱的第一部分、即第一发射波长范围，其中(基本上排他地)在该第二检测区域(第二通道)中检测位于该荧光谱的第一部分附近的波长范围、即第一修正波长范围，并且其中(基本上排他地)在该第三检测区域(第三通道)中检测该荧光染料的激发谱的一部分、即第二修正波长范围。
“基本上排他地”是指，该显微镜系统的将目标区域(富集有荧光染料的组织可以存在于该目标区域中)成像到检测区域上的光学器件被如此配置：来自该目标区域的第一发射波长范围的光至少75％、优选至少90％、进一步优选至少99％被导向该第一检测区域，来自该目标区域的第一修正波长范围的光至少75％、优选至少90％、进一步优选至少99％被导向该第二检测区域，并且来自该目标区域的第二修正波长范围的光至少75％、优选至少90％、进一步优选至少99％被导向该第三检测区域。
替代地，“基本上排他地”可以如此定义：在检测区域中某一波长的光的强度与在其他检测区域中相同波长的光的强度之比为至少10:1、优选至少100:1、进一步优选至少1000:1的值。
由此该检测系统提供三个(图像)信号，这些信号代表空间强度分布
由此该控制器被配置为从信号
为了能够分别检测作为强度分布
在上述的显微镜系统中利用了以下情况：在荧光染料的吸收谱(中的峰)与荧光染料的发射谱的(主)峰之间存在相对较大的波长范围，使得第一修正波长范围和第二修正波长范围不重叠或基本上不重叠。第一修正波长范围和第二修正波长范围因此在不同的通道中由不同的检测区域来检测。
然而荧光染料可能具有多个局部吸收最大值和多个局部发射最大值，或者主吸收峰与主发射峰之间的波长范围可以很小。在这种情况下可能有利的是，将相同的检测区域用于第一修正波长范围以及第二修正波长范围。在此情况下第一修正波长范围和第二修正波长范围在谱上看是在彼此附近或至少部分或显著重叠的。于是可以将唯一的检测区域用于检测第一修正波长范围以及第二修正波长范围。于是也仅仅提供一个(唯一的)修正信号来确定荧光染料浓度的空间分布的近似值。多通道图像检测器的同样包括检测第一和第二修正波长范围的检测区域的其他通道因此可以用于记录总图。刚刚描述的显微镜系统因此利用上述对于近似值的表达的特殊情况，对于该情况iko1可以看作是iko2的近似值。
由此对于这种特殊情况产生了另一个用于确定目标区域中荧光染料浓度的空间分布的近似值的函数，其中此函数包括第一荧光信号和第一修正信号作为参数，该第一修正信号代表第一修正波长范围以及第二修正波长范围的光。此函数尤其可以包括以下内容作为项：
其中
iko表示该第一修正信号，
b表示参数，并且
γ表示另一个参数。
附图说明
在下文中结合附图描述本发明的实施方式。
图1示出根据一种实施方式的立体显微镜的示意性图示。
图2示出图1的立体显微镜的元件的示例性谱配置。
图3a至3d示出图1的立体显微镜的照射光和第一光学过滤器的示例性谱配置。
图4示出图1的立体显微镜的照射光和其他元件的示例性谱配置。
图5示出根据另一种实施方式的立体显微镜的示意性图示。
图6示出多通道图像检测器的检测区域的空间配置。
图7示出图5的立体显微镜的检测区域的示例性谱配置。
图8示出图1的立体显微镜的照射光和元件的另一种示例性谱配置。
图9示出图1的立体显微镜的光学过滤器的另一种示例性谱配置。
具体实施方式
图1示出根据另一种实施方式的显微镜系统1的示意性图示。
显微镜系统1包括照射装置3，该照射装置被配置为产生照射光5并将其指向目标区域7。照射装置5可以包括一个或多个窄带和/或宽带光源以及一个或多个照射过滤器，以产生照射光5。
在目标区域7中例如可以排列具有荧光染料的组织。荧光染料例如可以是原卟啉ix(ppix)，其吸收谱(33)在约350nm与650nm之间，其中主要的吸收峰在405nm处，并且其发射谱(35)在600nm与750nm之间，其中主要的吸收峰在635nm和705nm处(参见图2中的图表31)。
显微镜系统1还包括第一检测系统9和第一光学器件11。
第一检测系统9包括第一荧光图像检测器17和第一多通道图像检测器19。第一荧光图像检测器17是图像检测器，也就是荧光图像检测器17输出代表图像的信号，其中该图像代表在某一时间段之内在荧光图像检测器17的检测区域上出现的光强度。第一荧光图像检测器17可以依据应用不同而被配置为单色传感器或多通道图像检测器，其中多通道图像检测器适合用于检测多个不同的通道。
第一多通道图像检测器19同样是图像检测器。多通道图像检测器具有多个不同的检测区域，这些检测区域可以分别检测一个通道的光并且对每个通道输出一个信号。在本文中“通道”代表波长范围。这些通道在谱上最多部分重叠。例如第一多通道图像检测器的这些通道两两重叠最多100nm、优选最多50nm。多通道图像检测器的实例是常规的rgb彩色摄像机。
常规的rgb彩色摄像机具有红色(r)、绿色(g)和蓝色(b)通道。在此蓝色通道可以包括400nm至530nm的波长范围，绿色通道可以包括460nm至600nm的波长范围，红色通道可以包括570nm至750nm的波长范围。
第一光学器件11包括物镜21和第一分束器23。第一光学器件11可以包括另外的光学元件，例如第一成像透镜25或者在图1中未示出的第一缩放元件，该第一缩放元件可以安排在第一成像透镜25与物镜21之间。
第一光学器件11被配置为在第一荧光图像检测器17和多通道图像检测器19的检测区域上将目标区域7成像，如通过第一射束路径27所展示的。第一光学器件11可以包括过滤器和bayer图案类型的过滤器矩阵，其直接安排在检测区域前方。也就是说，本文中的光学器件还包括与检测器固定连接的过滤器。
光学器件被配置为将一定波长的光基本上排他地导向(每个立体射束路径的)这些检测区域中的唯一的检测区域。
图2示出对于安排在目标区域7中的示例性荧光染料的照射光5、第一荧光图像检测器17、第一多通道图像检测器19和第一分束器23的谱配置。
图表31示出(对其最大值)归一化的吸收谱33和(对其最大值)归一化的发射谱35。吸收谱33和发射谱35对应于ppix荧光染料的吸收谱和发射谱。
图表41示出取决于波长的照射光5的强度。在从λem1l延伸到λem1h的第一发射波长范围em1中，照射光5最多具有第一强度w1。也就是说在从λem1l到λem1h的整个波长范围中，照射光5在任何波长处都没有比第一强度w1更大的强度。第一发射波长范围em1包括发射谱35的至少一个第一部分。在发射谱的第一部分中，(对发射谱35的最大值)归一化的发射具有例如至少1％、优选至少5％、进一步优选至少10％的值。
第一修正波长范围ko1在谱上处于第一发射波长范围em1附近。例如第一修正波长范围ko1处于λem1l-150nm与λem1h+150nm之间的范围内。第一修正波长范围ko1与第一发射波长范围em1不重叠。在第一修正波长范围ko1中照射光5至少具有第二强度w2。也就是说在整个修正波长范围ko1中，照射光5在任何波长处都没有比第二强度更小的强度。第一强度w1例如比第二强度w2小至少2、5、10、20、50、100、1000或10000倍，由此用第一修正波长范围ko1的光照射目标区域7，而第一发射波长范围em1基本上不被照射。
第二修正波长范围ko2包括荧光染料的激发谱33的第一部分。激发谱33的第一部分例如具有至少1％、优选至少5％、进一步优选至少10％的(对吸收谱33的最大值)归一化的吸收。在第二修正波长范围ko2中照射光5至少具有第二强度w2。也就是说在整个第二修正波长范围ko2中，照射光5在任何波长处都没有比第二强度更小的强度。由此激发了荧光染料，从而使荧光染料在发射谱35中发射光。
在图2中所示的实例中，第一发射波长范围em1从610nm延伸到655nm；第一修正波长范围ko1从560nm延伸到595nm；并且第二修正波长范围ko2从390nm延伸到420nm。替代地，第一发射波长范围em1可以从640nm延伸到710nm；并且第二修正波长范围ko2可以从430nm延伸到450nm。
第一光学器件11的第一分束器23可以例如是二色性的分束器。也就是说第一分束器23可以被配置为，将具有大于第一极限波长λ1的波长的光基本上排他地输出到第一荧光图像检测器17并且将具有小于该第一极限波长λ1的波长的光基本上排他地输出到第一多通道图像检测器19。“基本上排他地”例如是指，在高于第一极限波长λ1的波长范围内在第一输出端(到第一荧光图像检测器17)中的平均透射率与在相同波长范围内在第二输出端(到第一多通道图像检测器19)中的平均透射率之比为至少100、优选至少1000或进一步优选至少10000。
如在图2中所示的实例中一样，第一极限波长λ1可以位于第一发射波长范围em1与第一修正波长范围ko1之间。在图2中所示的实例中，第一极限波长为600nm。由此，将来自目标区域7的第一发射波长范围em1的光(基本上排他地)输出到第一荧光图像检测器17。将来自目标区域7的第一修正波长范围ko1的光(基本上排他地)输出到第一多通道图像检测器19；并且将来自目标区域7的第二修正波长范围ko2的光(基本上排他地)输出到第一多通道图像检测器19。
替代于二色性的分束器，也可以将常规分束器与对应的过滤器一起使用，以实现相同的效果。安排在常规的分束器与第一荧光图像检测器17之间的过滤器还例如排他地在第一发射波长范围em1中具有高透射率。安排在常规的分束器与第一多通道图像检测器19之间的过滤器还例如在第一和第二修正波长范围中分别具有高透射率并且在第一发射波长范围em1中具有低透射率。高透射率与低透射率之比例如可以为至少100、优选至少1000或进一步优选至少10000。
通过分束器23和在谱上将第二通道与第三通道彼此分离的另外的过滤器，第一光学器件11被配置为：同时地，将来自目标区域7的第一发射波长范围em1的光成像到第一荧光图像检测器17的第一检测区域上，将来自目标区域7的第一修正波长范围ko1的光成像到第一多通道图像检测器19的第二检测区域上，并且将来自目标区域7的第二修正波长范围ko2的光成像到第一多通道图像检测器19的第三检测区域上。另外的过滤器例如是具有常规rgb彩色摄影机的那些。
第一荧光图像检测器17被配置为在第一检测区域中检测第一通道的光。在第一检测区域内检测第一通道的光并将其转换成第一荧光信号。换言之，“通道”表示如下波长范围：对于该波长范围，第一荧光图像检测器17的检测范围具有不可忽略的对光的敏感性。由第一荧光图像检测器17输出的荧光信号因此代表在预定的时间段之内出现在第一检测区域上的第一通道的光的强度。
图表51展示了第一通道ch1。第一通道ch1包括第一发射波长范围em1。因此通过第一检测区域检测第一发射波长范围em1的光并且输出对应的信号，即荧光信号。在当前实例中，第一通道ch1从约600nm延伸到670nm。
第一多通道图像检测器19被配置成在第二检测区域内检测第二通道ch2的光并将其转换成第一修正信号。图表52展示了第一多通道图像检测器19的第二通道ch2。第二通道ch2包括第一修正波长范围ko1。在当前实例中，第二通道ch2从约550nm延伸到700nm。这几乎对应于常规rgb彩色摄影机的红色通道。
此外，第一多通道图像检测器19被配置成在第三检测区域内检测第三通道ch3的光并将其转换成第二修正信号。图表53展示了第一多通道图像检测器19的第三通道ch3。第三通道ch3包括第二修正波长范围ko2。在当前实例中，第三通道ch3从约350nm延伸到540nm。这几乎对应于常规rgb彩色摄影机的蓝色通道。
在此参照图1，显微镜系统1还包括控制器29，该控制器从第一荧光图像检测器17或从第一多通道图像检测器19接收第一荧光信号、第一修正信号和第二修正信号。该控制器被配置为处理第一荧光信号、第一修正信号和第二修正信号并且由此确定在目标区域7中荧光染料浓度的空间分布的近似值。
通过同时且基本上排他地将第一发射波长范围em1成像到第一检测范围上、将第一修正波长范围ko1成像到第二检测范围上、以及将第二修正波长范围ko2成像到第三检测范围上，能够同时获得这三个波长范围的信号。由此可以重复、快速地计算在目标区域7中荧光染料浓度的近似值。
下文描述基于与图1和图2相关联地描述的实施方式的其他实施方式。
根据另一个实施方式，光学器件11还包括第一光学过滤器61(参照图1)，该第一光学过滤器安排在第一分束器23与第一多通道图像检测器19之间。在第一修正波长范围ko1中第一光学过滤器61的平均透射率可以为至少50％、优选至少80％、进一步优选至少90％。此外在第二修正波长范围ko2中第一光学过滤器61的平均透射率可以为至少50％、优选至少80％、进一步优选至少90％。此外在第一修正波长范围ko1与第二修正波长范围ko2之间第一光学过滤器61的平均透射率可以为最多30％、优选最多10％、进一步最多至少1％。
在图3a至3d中展示了照射装置和第一光学过滤器61的各种实施方式。
在根据图3a的实施方式中，照射光5在约400nm至约600nm的波长范围内至少具有第二强度w2，其中二色性分束器23的第一极限波长λ1位于约600nm。在这个波长范围之外，照射光5最多具有第一强度w1，也就是从600nm到至少720nm。在此从400nm至600nm的波长范围包括第一和第二修正波长范围。
第一光学过滤器61在从约400nm至约600nm的波长范围内具有高平均透射率t并且在此波长范围之外具有低透射率。例如在400nm与600nm之间第一光学过滤器(61)的平均透射率可以为至少50％、优选至少80％、进一步优选至少90％。由此在第一和第二修正波长范围内照射目标区域7并且在目标区域7处反射的第一和第二修正波长范围的光通过第一过滤器61在第一多通道图像检测器19上成像。在那里，在不同的通道中，即在第二及第三通道中，检测从第二检测区域和第三检测区域反射的光。
在此实施方式中，第一发射波长范围em1可以例如包括635nm左右的范围、705nm左右的范围或者635nm至705nm的范围。在第一发射波长范围(em1)中第一光学过滤器(61)的平均透射率最多可以具有比在第一修正波长范围(ko1)和/或第二修正波长范围(ko2)中第一光学过滤器(61)的平均透射率小至少10倍、优选100倍、进一步优选1000倍的值(w3)。
由此，当第一多通道图像检测器19例如是常规的rgb彩色摄影机时，可以用bgb摄影机记录色彩保真的总图并且此外还可以将红色通道(包括第一修正波长范围ko1)的信号和蓝色通道(包括第二修正波长范围ko2)的信号用于确定荧光染料浓度的空间分布。虽然由此可以产生特别色彩保真的总图，但是红色通道的信号不仅代表第一修正波长范围ko1的光的强度，而是还代表红色通道之内的其他波长的光的强度。同样的内容对应地适用于蓝色通道。这可能负面地影响确定荧光染料浓度的空间分布的准确度。
如在图3b中展示的，根据另一个实施方式的照射光5对应于在图3a中所示的实施方式中使用的照射光5。根据图3b的第一过滤器61仅仅在第一修正波长范围ko1和第二修正波长范围ko2中具有高透射率并且在其余范围具有低透射率。例如在第一修正波长范围(ko1)与第二修正波长范围(ko2)之间第一光学过滤器(61)的平均透射率最多具有比在第一修正波长范围(ko1)和/或第二修正波长范围(ko2)中第一光学过滤器(61)的平均透射率小至少10倍、100倍、或1000倍的值(w3)。根据图3b的第一过滤器61中具有高透射率的区域还可以在每个方向上比第一或第二修正波长范围宽出5nm至25nm。
由于抑制了可见光谱的一个区段，在此实施方式中用常规rgb摄影机(用于第一多通道图像检测器19)获得的总图不是色彩保真的。然而改进了确定荧光染料浓度的空间分布的准确度，因为仅仅将第一修正波长范围ko1的光送入第二检测区域(红色通道)并且因为仅仅将第二修正波长范围ko2的光送入第三检测区域(蓝色通道)。
用在图3c中展示的实施方式实现了同样的效果。在此，照射光5排他地在第一修正波长范围ko1和第二修正波长范围ko2中至少具有第二强度w2并且在其余范围内仅仅最多具有第一强度w1。根据图3c的第一过滤器61对应于根据图3a的第一过滤器61。
能够通过根据图3d的配置实现改进的色彩保真度以及同时在确定荧光染料浓度的空间分布时的高准确度。为此，第一多通道图像检测器19还具有第四检测区域，通过该第四检测区域可以检测第四通道ch4的光并且转换第四通道的信号。第四通道ch4与第二和第三通道分别最多部分地重叠。在常规rgb彩色摄影机中，第四通道例如对应于绿色通道，该绿色通道示例性地在图2中在图表54中展示。
照射光5在包含于第四通道ch4(绿色通道)中的补充波长范围g1中具有平均的第四强度w4。平均的第四强度可以为第二强度(w2)的0.01％至50％、优选为该第二强度(w2)的0.05％至10％、进一步优选为该第二强度(w2)的0.1％至1％。在此第一强度(w1)可以比该平均的第四强度(w4)小至少10倍、优选至少100倍、进一步优选至少1000倍。
该照射光5在该第一修正波长范围ko1与该补充波长范围g1之间以及在该补充波长范围g1与该第二修正波长范围ko2之间可以例如最多具有第一强度w1。补充波长范围g1可以例如包括520nm至570nm的波长范围。
在第一修正波长范围(ko1)中和第二修正波长范围(ko2)中第一光学过滤器(61)的平均透射率例如分别为在补充波长范围(g1)中第一光学过滤器(61)的平均透射率的0.01％至50％、优选在补充波长范围(g1)中第一光学过滤器(61)的平均透射率的0.05％至10％、进一步优选在补充波长范围(g1)中第一光学过滤器(61)的平均透射率的0.1％至1％。
在第一修正波长范围(ko1)与补充波长范围(g1)之间以及在补充波长范围(g1)与第二修正波长范围(ko2)之间第一光学过滤器(61)的平均透射率分别比在第一修正波长范围(ko1)和/或第二修正波长范围(ko2)中第一光学过滤器(61)的平均透射率小至少10倍、优选至少100倍、进一步优选至少1000倍。
根据另一个实施方式，显微镜系统1是如在图1中展示的立体显微镜系统。为此，图1中展示的显微镜系统1还包括第二检测系统109和第二光学器件111。第二检测系统109可以与第一检测系统9类似或相同地配置。第二光学器件111可以与第一光学器件11类似或相同地配置。
第二检测系统109包括第二荧光图像检测器117和第二多通道图像检测器119。第二荧光图像检测器117可以与第一荧光图像检测器17类似或相同地配置。第二多通道图像检测器119可以与第一多通道图像检测器19类似或相同地配置。
如果第二检测系统109和第一检测系统9相同地配置，则它们分别具有相同的谱配置。
替代于此，第二荧光图像检测器117和第二多通道图像检测器119可以具有另一种谱配置，从而能够检测另一个发射波长范围。
为此，第二荧光图像检测器117被配置为检测第二发射波长范围em2，该第二发射波长范围与第一发射波长范围em1不同。第二发射波长范围em2从λem2l延伸到λem2h并且为荧光染料的发射谱35的第二部分。第一发射波长范围em1和第二发射波长范围em2可以例如部分地重叠或不重叠。第一发射波长范围em1和第二发射波长范围em2例如可以最多重叠50nm、尤其最多20nm或最多10nm。
第二荧光图像检测器117被配置成在第五检测区域内检测第四通道的光并将其转换成第二修正信号。此外，第二多通道图像检测器119被配置成在第六检测区域内检测第六通道的光并将其转换成第三修正信号。此外，多通道图像检测器119被配置成在第七检测区域内检测第七通道的光并将其转换成第四修正信号。
示例性谱配置的实例展示在图4中。
图表31示出归一化的吸收谱33和归一化的发射谱35。图表41示出取决于波长的照射光5的强度。
图表151展示了第五通道ch5。第五通道ch5包括第二发射波长范围em2。因此通过第五检测区域检测第二发射波长范围em2的光并且输出对应的信号。在当前实例中，第二发射波长范围em2包括680nm至720nm的波长。第二发射波长范围em2尤其包括705nm的波长。
图表152展示了第二多通道图像检测器119的第六通道ch6。第六通道ch6包括第三修正波长范围ko3。第三修正波长范围ko3位于λem2l-150nm与λem2h+150nm之间并且与该第二发射波长范围em2不重叠。在当前实例中，第六通道ch6从约550nm延伸到超过700nm。这几乎对应于常规rgb彩色摄影机的红色通道。
图表153展示了第二多通道图像检测器119的第七通道ch3。第七通道ch7包括第四修正波长范围ko4。第四修正波长范围ko4包括荧光染料的激发谱33的第二部分。在当前实例中，第七通道ch7从约350nm延伸到540nm。这几乎对应于常规rgb彩色摄影机的蓝色通道。
于是可以通过不同的检测器、即第一和第二荧光图像检测器，彼此分离地检测发射谱的不同部分。
照射光5在第二发射波长范围em2中最多具有第一强度w1。此外照射光5在第三修正波长范围ko3和第四修正波长范围ko4中至少具有第二强度。
包括物镜21和第二分束器123的第二光学器件111被配置为：将来自目标区域的第二发射波长范围em2的光(基本上排他地)成像到第五检测区域上，将来自目标区域的第三修正波长范围ko3的光(基本上排他地)成像到该第六检测区域上，以及将来自目标区域的第四修正波长范围ko4的光(基本上排他地)成像到该第七检测区域上。第二分束器123尤其可以是具有第二极限波长λ2的二色性分束器或者与第一分束器23一样地配置。
控制器29还被配置为：还在使用第二荧光信号、第三修正信号和第四修正信号的情况下确定在目标区域7中荧光染料的浓度的空间分布的近似值。
图5示出用于同时记录总图并确定在目标区域中的组织中的荧光染料浓度的显微镜系统200的另一个实施方式。
显微镜系统200的与图1中所示的显微镜系统1相同的部件用相同的附图标记来标示并且可参照其说明。
显微镜系统200包括照射装置3，该照射装置被配置为产生照射光5并将其指向目标区域7。
显微镜系统200包括第一光学器件211，该第一光学器件包括物镜21并且被配置为将来自目标区域7的光成像到第一多通道图像检测器203上。第一光学器件211可以包括成像透镜25，如在图5中所示的一样。此外第一光学器件211可以包括缩放系统(未示出)。
第一多通道图像检测器203被配置为：在第一检测区域d1内检测第一通道ch1的光并将其转换成第一荧光信号，在第二检测区域d2内检测第二通道ch2的光并将其转换成第一修正信号，以及在第三检测区域d3内检测第三通道ch3的光并将其转换成第二修正信号。第一多通道图像检测器203的这些通道在谱上基本不重叠，使得这些检测区域中的每一个都基本上排他地检测与之相关联的通道。以此方式可以同时检测不同的谱区域。
对于两个彼此邻接的或部分重叠的通道m和n，例如可以适用如下条件：
其中
sm代表对于通道m对最大灵敏度归一化的检测区域灵敏度，
sn代表对于通道n对最大灵敏度归一化的检测区域灵敏度，
λ代表波长，并且
w为20％、优选10％、进一步优选1％。
第一多通道图像检测器203的配置的实例在图6和图7中展示。图6示出第一多通道图像检测器203的检测区域d1、d2、d3和d4的示例性空间安排。在此实例中，第一多通道图像检测器203具有另外的第四检测区域d4，通过该第四检测区域，第一多通道图像检测器203被配置为检测第四通道ch4的光并输出对应的信号。第一检测区域d1由多个规则排列的像素组成。第二检测区域d2、第三检测区域d3和第四检测区域d4同样分别由规则排列的像素组成，其中不同的检测区域在空间上不重叠。
图7展示了第一多通道图像检测器203的通道。换言之，图7示出如下的波长范围作为通道：在这些波长范围中，相应的检测区域具有对光的显著敏感性。例如当在某一波长的敏感度为检测区域的最大敏感度的至少10％、优选至少30％时，可以认为对于该波长而言敏感性是显著的。
在当前实例中，第一检测区域d1被配置为检测在635nm周围的波长范围(第一通道ch1)中的光。第一通道ch1尤其包括从610nm至650nm的波长范围。
第四检测区域d4被配置为检测705nm左右的波长范围(第四通道ch4)的光。第四通道尤其包括从650nm至720nm的波长范围。
第二检测区域d2被配置为检测600nm左右的波长范围(第二通道ch2)的光。第二通道ch2尤其包括从560nm至610nm的波长范围。
第三检测区域d3被配置为检测405nm左右的波长范围(第三通道ch3)的光。第三通道ch3尤其包括从390nm至450nm的波长范围。
单独检测区域的谱配置可以例如通过带通滤波器来实现，其制造对本领域技术人员而言是常规的。
再次参照图5，照射装置3被配置为如下产生照明光5，使得该照射光在第一发射波长范围em1中最多具有第一强度w1，该第一发射波长范围是荧光染料的发射谱35的一部分(参照图2)并且被包含在第一通道ch1中。第一发射波长范围em1从λem1l延伸到λem1h。
此外照射光5在第一修正波长范围ko1和第二修正波长范围ko2中分别至少具有第二强度w2。第一修正波长范围ko1被包含在第二通道ch2中；而且第二修正波长范围ko2被包含在第三通道ch3中。第一修正波长范围ko1位于第一发射波长范围em1附近，例如在λem1l-150nm与λem1+150nm之间并且与第一发射波长范围em1不重叠。第二修正波长范围ko2包括荧光染料的激发谱的一部分。第一强度w1至少比第二强度w2小2倍。这例如在图2的图表41中示例性展示。
显微镜系统200还包括控制器29，该控制器被配置为：在使用第一荧光信号、第一修正信号和第二修正信号的情况下确定在目标区域7中荧光染料浓度的空间分布的近似值。
如在图6和图7中展示的，第一多通道图像检测器203具有第四检测区域d4，该第四检测区域被配置为检测第四通道ch4的光。第四通道可以例如如下地选择，使得该第四通道包括第二发射波长范围em2，该第二发射波长范围是荧光染料的发射谱的第二部分并且与第一发射波长范围不重叠。以此方式可以在多个不同的波长范围中对发射谱进行采样并且于是多个荧光信号可用于确定荧光染料浓度的空间分布的近似值。第二发射波长范围em2例如可以包括从670nm至710nm的波长范围并且尤其包括705nm的波长。
替代地，第四通道ch4可以被配置为检测位于荧光染料的发射谱(35)之外、第二通道ch2之外且第三通道ch3之外的可见光谱范围中的波长范围，以便由此改进总图的色彩保真度。第四通道ch4例如可以包括500nm左右的波长范围，以便检测绿色光的波长范围。
另外替代性地，多通道图像检测器203可以被配置为使得第一通道ch1和第四通道ch4在谱上至少部分重叠。于是第一发射波长范围em1和第二发射波长范围em2也可以在谱上部分重叠。第一发射波长范围em1和第二发射波长范围em2之间的重叠例如可以为最多50nm、尤其最多20nm或最多10nm。第一通道ch1与第四通道之间的重叠例如可以为最多100nm、尤其最多50nm或最多20nm。
如在图5中展示的，显微镜系统200可以形成为立体显微镜系统。为此，显微镜系统200还包括第二光学元件311，该第二光学元件被配置为将目标区域7成像到第二多通道图像检测器303上。第二多通道图像检测器303可以与第一多通道图像检测器203类似地或相同地配置。
下文参照图1、8和9来描述另一个实施方式。根据此实施方式的显微镜系统基本上对应于图1中所示的显微镜系统1，其中照射光5、第一光学器件11、第二光学器件111以及第一检测系统9和第二检测系统109具有不同的谱配置，这些谱配置在图8和图9中展示。
显微镜系统1包括第一检测系统9，该第一检测系统包括第一荧光图像检测器17和第一多通道图像检测器19。第一荧光图像检测器17被配置成在第一检测区域内检测第一通道ch1的光并将其转换成第一荧光信号。第一多通道图像检测器19被配置成在第二检测区域内检测第二通道ch2的光并将其转换成第一修正信号。
照射装置3被配置为产生照射光5并将其指向目标区域7。
图8示出显微镜系统的示例性谱配置。图表31示出荧光染料的谱配置。图表41示出照射光5的谱强度分布。
图表51示出第一荧光图像检测器17的第一检测区域的谱配置。图表52示出第一多通道图像检测器19的第二检测区域的谱配置。图表53示出第一多通道图像检测器19的第三检测区域的谱配置。
如在图表41中展示的，照射光5在修正波长范围ko中至少具有第二强度w2并且在第一发射波长范围em1中最多具有第一强度w1。通过照射光5的这种配置，基本上在该波长范围内激发荧光染料。也就是说，修正波长范围ko包括荧光染料的激发谱33的至少一部分。此外修正波长范围ko处于λem1l-15nm与λem1h+150nm之间的范围内，其中第一发射波长范围em1从λem1l延伸到λem1h并且为荧光染料的发射谱35的第一部分。第一发射波长范围em1和修正波长范围ko在谱上不重叠。
再次参照图1，第一光学器件11被配置为：同时地，将来自目标区域7的第一发射波长范围em1的光成像到第一荧光图像检测器17的第一检测区域上，并且将来自目标区域7的修正波长范围ko的光成像到多通道图像检测器19的第二检测区域上。
如图8中所展示的，第一荧光图像检测器17的第一通道ch1包括第一发射波长范围em1。另外第一多通道图像检测器19的第二通道ch2包括修正波长范围ko。
根据此配置，在该波长范围ko中激发荧光染料。例如修正波长范围ko包括630nm的波长，在此波长下荧光染料ppix具有局部的吸收最大值。优选地，修正波长范围ko包括620nm至650nm的波长范围、进一步优选610nm至660nm的波长范围。
以此方式激发的荧光染料在705nm附近的次最大值发射荧光。第一发射波长范围em1因此包括705nm的波长。优选地，第一修正波长范围包括680nm至710nm的波长范围、进一步优选670nm至720nm的波长范围。
显微镜系统1还包括分束器23，该分束器例如可以配置为具有例如660nm的极限波长λ1的二色性分束器。替代地，第一分束器23可以是常规的分束器，并且显微镜系统1还可以包括过滤器，使得分束器23与过滤器相结合地将发射波长范围em1的光基本上排他地成像到第一荧光图像检测器17上并且修正波长范围ko的光基本上排他地成像到多通道图像检测器19上。第一分束器23的极限波长相应地位于第一发射波长范围em1与修正波长范围ko之间，优选在600nm与700nm之间、进一步优选在655nm与675nm之间、仍进一步优选在660nm。
通过这种谱配置，来自目标区域7的第一发射波长范围em1的光基本上排他地成像到第一检测区域并且由此在第一通道ch1中进行检测。来自目标区域7的修正波长范围ko的光相应地基本上排他地成像到第二检测区域中并在第二通道ch2中进行检测。
为了产生色彩保真的总图，照射光5在补充波长范围g2中具有平均的第五强度w5，该第五强度小于第二强度w2然而大于第一强度w1。例如平均的第五强度为该第二强度w2的0.01％至50％、优选为该第二强度w2的0.05％至10％、进一步优选为该第二强度w2的0.1％至1％。
第一光学器件11还包括第一光学过滤器61，该第一光学过滤器安排在第一分束器23与第一多通道图像检测器19之间。图9示出第一光学过滤器61的谱配置。在修正波长范围ko中第一光学过滤器61的平均透射率为在补充波长范围g2中第一光学过滤器61的平均透射率的0.01％至50％。在第一发射波长范围em1中第一光学过滤器的平均透射率可以比在修正波长范围ko中第一光学过滤器61的平均透射率小至少10倍。在修正波长范围中第一光学过滤器61的平均透射率优选具有在补充波长范围g2中第一光学过滤器61的平均透射率的0.05％至10％、进一步优选在补充波长范围g2中第一光学过滤器61的平均透射率的0.1％至1％。在第一发射波长范围em1中第一光学过滤器61的平均透射率优选比在修正波长范围ko中第一光学过滤器61的平均透射率小至少100倍或进一步优选至少1000倍。
第一多通道图像检测器19还可以被配置成在第三检测区域内检测第三通道ch3的光并将其转换成至少一个彩色信号，其中该至少一个第三通道ch3与该第二通道ch2最多部分重叠并且其中该至少一个第三通道ch3至少部分包括补充波长范围g2。在图8中展示的实例中，图表53示出第一多通道图像检测器19的第三检测区域的谱配置。第三通道ch3至少部分包括补充波长范围g2。如在上文实例中一样，第一多通道图像检测器19可以是常规的rgb彩色摄影机。
在图1中展示的显微镜系统1的改进方案中，替代于荧光图像检测器17或117，设置有另一个多通道图像检测器，该另一个多通道图像检测器被配置为在至少两个不同的通道中检测两个不同的发射波长范围并且对于每个通道输出一个分开的荧光信号。例如，此多通道图像检测器被配置为，在一个通道中检测波长635nm左右的波长范围并且在另一个通道中检测705nm左右的波长。如此提供的荧光信号于是可以如上所述地用于确定在目标区域中的荧光染料浓度的空间分布的近似值。
在先前阐述的实施方式中，第一发射波长范围em1可以是至少10nm、至少20nm、至少50nm或至少100nm宽。第一修正波长范围ko1可以是至少10nm、至少20nm、优选至少50nm、进一步优选至少100nm宽。第二发射波长范围ko2可以是至少10nm、至少20nm、优选至少50nm、进一步优选至少100nm宽。
此外第二发射波长范围em2可以是至少10nm、至少20nm、至少50nm或至少100nm宽。第三修正波长范围ko3可以是至少10nm、至少20nm、优选至少50nm、进一步优选至少100nm宽。第四修正波长范围ko4可以是至少10nm、至少20nm、优选至少50nm、进一步优选至少100nm宽。
根据另一个实施方式，第一分束器23的第一极限波长λ1和/或第二分束器123的第二极限波长λ2可以在600nm至700nm、尤其在660nm。
根据另一个实施方式，在第一分束器(23)与第一荧光图像检测器(17)之间安排有第二光学过滤器，其透射行为模仿第一分束器(23)。替代地，第二光学过滤器被配置为基本上排他地透射发射波长范围的光并且抑制发射波长范围之外的光。可以在第二分束器(123)与第二荧光图像检测器(117)之间安排另一个第二分束器。