本发明属于生物量测定领域，具体涉及真菌在液体发酵液中的生物量测定技术。
背景技术：
当前生物量的测定方法很多，然而许多生物量的测定方法操作较为繁琐，并且易受菌龄、培养条件、培养基质的干扰，如麦角固醇法等；此外，测定碳源氮源的消耗、呼吸速率、称干重等检测方法并不总能准确地反映生物量的变化情况。qpcr技术虽然既能做到高通量检测，其检测结果又相对准确，但其需要引物设计，难度较大、成本较高，因此构建一种较为准确便捷的菌体生物量的测定方法成为当前急需解决的问题。
由于微生物在培养环境中会对金属离子进行利用，因此可根据菌体中金属离子含量来间接测定菌量。为了简便而迅速地获取检测结果，以便于后续进行高通量检测，本发明采用改进的显色法来对金属离子进行测定。由于常见的培养基中均含有钠、钾、镁离子，而镁离子在菌体内部含量较为稳定，因此可用过菌体内部镁离子含量来推测菌量。
通过一系列的排除干扰的手段来提高本方法测定的准确度，使得以菌体内部镁离子含量来表征菌体生物量成为可能，本方法简单易行，操作便捷，试剂用量小，其检测结果能够很好地反应液态发酵过程中菌量的变化趋势。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种真菌液态发酵生物量的快速测定方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用生理盐水对孔板培养后的发酵液沉淀进行清洗后，基于酶标仪以铬黑t双波长显色法对菌体内部的镁离子进行测定，通过镁离子的含量来反映菌体生物量。
镁离子浓度测定方法的改良：
如图1所示，由于显色剂与络合物的吸收波长有较大的重叠，若单单使用显色剂的消光曲线或络合物的吸光曲线则难以真实反应溶液中镁离子含量，因此，使用双波长法，用△a=a560-a680来屏蔽络合物最大吸收波长处显色剂的干扰，以此来准确对镁离子进行定量。
钙离子对显色反应的影响：
由于铬黑t显色剂能对钙、镁离子进行络合并显色，因此钙离子的屏蔽尤为重要。本发明对铬黑t显色剂进行了改进，在铬黑t显色剂中加入了草酸钾，草酸钾与钙离子的络合能力比铬黑t强，因此即便显色体系中钙镁浓度比为2：1，依然能够排除钙离子的干扰。
对沉淀物表面的冲洗的必要性：
对生理盐水沉淀表面进行冲洗并离心弃上清。重复清洗3次后，沉淀表面几乎无镁离子。清洗后，才能准确对菌体内部的镁离子含量进行定量测定。
吸光值与纯菌体的菌量之间标曲的绘制：
如图5所示，测定结果显示，双波长的吸光值与纯菌体的菌量之间线性关系良好。故该方法可行。
双波长法与其他真菌测定方法的比较：
如图6所示，本发明所述的金属离子测定法与氨基葡萄糖法的变化趋势一致，发酵前期由于有培养基沉淀，因此称干重法在发酵前期不适用于测定生物量，而平板菌落技术法测的是发酵液中的孢子量，只有在菌丝体成熟后才能大量分泌孢子，因此平板菌落计数法有时间上的滞后性。简言之，本发明的方法能够很好地反应真菌在发酵过程中的菌量变化趋势。
整个操作过程具体包括以下步骤：
（1）在离心无沉淀的发酵培养基中接入孢子，发酵3天后对发酵液进行4500rpm离心10min，弃上清，获得纯菌体的沉淀；离心无沉淀的发酵培养基制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，无水葡萄糖42.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min；
（2）在离心有沉淀的发酵培养基中接入孢子，发酵3天后对发酵液进行4500rpm离心10min，弃上清，获得菌体和培养基的混合沉淀；离心有沉淀的发酵培养基制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，无水葡萄糖12.50g，籼米粉30.00g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min；
（3）在（1）和（2）中所获得的沉淀分别加入生理盐水，上下颠倒几次将沉淀打散，4500rpm离心5min弃上清再次获得沉淀；重复操作3次，将发酵液沉淀清洗干净；
（4）纯菌体经过三次清洗后，于水分活度仪上烘干，刮取菌体粉末，在0.29g菌体粉末中加入0.5g二氧化硅粉末和100ml去离子水，超声破碎30min，离心取上清，分别取0、0.2、0.5、1、2、3ml上清液加入0.4ml氨缓冲溶液、0.4mlebt溶液，去离子水定容至5ml，在酶标仪的560nm、680nm处测定吸光值，计算吸光差值△a=a560-a680，绘制吸光差值△a与纯菌体质量之间的标准曲线；
（5）在清洗后的菌体和培养基的混合沉淀中加入去离子水，沸水浴5min破坏菌体结构，再加入二氧化硅超声30min使菌体内镁离子溶于水中，4500rpm离心10min取0.2ml上清液转移至另一个24深孔板中，分别加0.4ml氨缓冲溶液、0.4mlebt溶液，4ml去离子水，于孔板振荡器上震荡均匀后取0.2ml于96微孔板中，在酶标仪的560nm、680nm处测定吸光值，计算吸光差值△a=a560-a680，根据吸光差值△a与纯菌体质量之间的标准曲线计算样品中菌体生物量；
其中，氨缓冲溶液制备：0.2g氯化铵于4.4ml浓氨水中，加水定容至100ml，其ph=10.5；ebt溶液制备：铬黑t和草酸钾加去离子水溶解并定容至铬黑t终浓度为0.05wt%，草酸钾终浓度为1wt%。
本发明的有益效果如下：1、本发明全部基于孔板操作和酶标仪检测，操作便捷性强，一次性可处理大批量的样品。
2、本发明克服了传统真菌菌量测定方法（称干重法）对于发酵前期难以测定菌体生物量的缺点，同时与其他测定方法对比，测定结果的相关性强，试剂用量少，试剂无腐蚀性（氨基葡萄糖法测定前需要用浓硫酸对细胞进行浸泡过夜，浓硫酸为强腐蚀性酸）。
3.对于改进的铬黑t显色法，能够屏蔽显色剂对络合物的干扰以及屏蔽钙离子对镁离子测定的干扰。
附图说明
图1为显色剂与络合物的全波长扫描图；
图2为络合物吸光曲线；
图3为不同浓度的钙离子对镁离子测定的影响；
图4为不同冲洗次数下菌体表面镁离子浓度；
图5为双波长下吸光值与菌体质量之间的关系曲线；
图6为不同测定方法跟踪红曲霉的发酵周期。
具体实施方式
实施例1红曲霉(monascus)菌量的测定
在离心无沉淀的发酵培养基中接入红曲霉孢子，发酵3天后对发酵液进行4500rpm离心10min，弃上清，获得红曲霉纯菌体的沉淀；离心无沉淀的发酵培养基制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，无水葡萄糖42.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min；
在离心有沉淀的发酵培养基中接入红曲霉孢子，发酵3天后对发酵液进行4500rpm离心10min，弃上清，获得红曲霉菌体和培养基的混合沉淀；离心有沉淀的发酵培养基制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，无水葡萄糖12.50g，籼米粉30.00g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min；
样品前处理：在低速离心后的红曲霉发酵液沉淀分别加入生理盐水，上下颠倒几次将沉淀打散，4500rpm离心5min弃上清再次获得沉淀；重复操作3次，将发酵液沉淀清洗干净。
纯菌体的标曲绘制：红曲霉纯菌体沉淀经过三次清洗后，于水分活度仪上烘干，刮取菌体粉末。在0.29g菌体粉末中加入0.5g二氧化硅粉末和100ml去离子水，超声破碎30min，离心取上清。分别取0、0.2、0.5、1、2、3ml上清液加入0.4ml氨缓冲溶液、0.4mlebt溶液，去离子水定容至5ml,以酶标仪△a=a560-a680测定吸光值，绘制吸光值△a与纯菌体质量之间的标准曲线，相关数据如表1所示。其中，氨缓冲溶液：0.2g氯化铵于4.4ml浓氨水中，加水定容至100ml(ph=10.5)；ebt溶液制备：铬黑t和草酸钾加去离子水溶解并定容至铬黑t终浓度为0.05wt%，草酸钾终浓度为1wt%。
表1红曲霉菌量测定标曲绘制的相关数据
△a与纯菌体质量之间的标准曲线为：y=0.2451x-0.0819，r2=0.991。
酶标法测定：在清洗后的菌体培养基混合沉淀中加入去离子水，沸水浴5min破坏菌体结构，再加入二氧化硅超声30min使菌体内镁离子溶于水中，4500rpm离心10min取0.2ml上清液转移至另一个24深孔板中，分别加0.4ml氨缓冲溶液、0.4mlebt溶液，4ml去离子水，于孔板振荡器上震荡均匀后取0.2ml于96微孔板中，在酶标仪的560nm、680nm处测定吸光值。计算吸光差值△a=a560-a680，根据吸光值△a与纯菌体质量之间的标准曲线计算样品中菌体生物量，同时与氨基葡萄糖法进行对比，对比结果如表2所示。
表2不同测定方法对比
两种测定方法的相关性系数为0.9127，表示有91.27%的把握认为两种测定方法相关。
实施例2米根霉(rhizopusoryzae)菌量的测定
金属离子法的测定步骤与实施例1中红曲霉菌量的操作步骤一致。米根霉的吸光值△a与纯菌体质量之间的标准曲线如表3所示。金属离子法与氨基葡萄糖法的测定比对如表4所示。
表3米根霉菌量测定标曲绘制的相关数据
△a与纯菌体质量之间的标准曲线为：y=3.7039x-0.0483，r2=0.9992。
表4不同测定方法对比
两种测定方法的相关性系数为0.9835，表示有98.35%的把握认为两种测定方法相关。
实施例3拟青霉(paecilomycessp.)菌量的测定
金属离子法的测定步骤与实施例1中红曲霉菌量的操作步骤一致。拟青霉的吸光值△a与纯菌体质量之间的标准曲线如表5所示。金属离子法与氨基葡萄糖法的测定比对如表6所示。
表5拟青霉菌量测定标曲绘制的相关数据
△a与纯菌体质量之间的标准曲线为：y=0.1135x-0.0609，r2=0.9986。
表6不同测定方法对比
两种测定方法的相关性系数为0.9825，表示有98.25%的把握认为两种测定方法相关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。