一种含银杏叶提取物的注射液中维生素C含量的测定方法与流程

本发明涉及医药分析技术领域。

背景技术：

银杏叶提取物具有扩张血管、改善微循环的作用。含银杏叶提取物的注射剂主要用于治疗用于缺血性心脑血管疾病，冠心病，心绞痛，脑栓塞，脑血管痉挛等。中药注射剂中往往为了保护主药，而加入维生素c、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等抗氧剂。随着抗氧剂在产品效期内的不断消耗，可能影响到注射剂的安全性、稳定性。因此维生素c用量的确定及在产品有效期内的变化需建立有效的监测控制手段，而这方面的研究相对较少。

中国药典2015年版采用碘量法测定维生素c的含量，文献已报道过的测定维生素c含量的方法还有2,6-二氯靛酚滴定法、电化学法、苯肼比色法、荧光分析法、分光光度法、高效液相色谱法等。因中药注射剂本身颜色的影响，对滴定法终点的判断有干扰；再者注射剂中除主药和维生素c外，还有其他辅料成分，增加了准确测定的难度。

维生素c在水溶液中呈互变异构的形式存在，性质不稳定，易被光、温度、氧气、金属离子、ph等影响。由于中药注射剂在生产过程中存在加惰性气体的保护，维生素c的降解相对较慢，但在实际测定过程中由于一般不添加惰性气体或抗氧剂导致维生素c降解较快，这也为维生素c的准确测定增加了难度。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种含银杏叶提取物的注射剂液中维生素c含量测定的方法，该方法可准确测定维生素c含量，各成分的色谱峰分离效果良好，且操作简单，快捷，易于掌握。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种含银杏叶提取物的注射液中维生素c含量的测定方法，包括以下步骤：

a、色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：乙腈-缓冲盐水溶液，其中乙腈与缓冲盐水溶液的体积比为1-30:99-70；

检测波长：265-285nm；

柱温：25-45℃；

流速：0.5-1.2ml/min；

所述缓冲盐水溶液可以是0.1-0.3mol/l的醋酸钠水溶液（用冰醋酸调节ph值至4-5）、0.1-0.3mol/l的醋酸铵水溶液（用冰醋酸调节ph值至4-5）、0.02-0.04mol/l的磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调节ph值至4-5）、0.1-0.3mol/l的磷酸二氢钠水溶液（用磷酸调节ph值至4-5）中的任意一种；

b、对照品溶液的制备：精密称取维生素c对照品置棕色量瓶中，加酸性试剂溶解定容，制备成对照品溶液；

所述对照品溶液中维生素c浓度为0.05-0.25mg/ml，优选0.15mg/ml。

c、供试品溶液的制备：精密量取含银杏叶提取物的注射剂置棕色量瓶中，加酸性试剂稀释5-10倍体积，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

所述含银杏叶提取物的注射剂是指由银杏科植物银杏的干燥叶经提取加工制成的含银杏黄酮醇苷和/或银杏内酯的注射用无菌水溶液。

步骤b、步骤c中所述酸性试剂为1%草酸溶液或0.85-1%醋酸溶液或0.004-0.006mol/l盐酸溶液或流动相中的缓冲盐水溶液中的任意一种；

d、测定方法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液5-50ul，注入高效液相色谱仪，测定，外标法计算维生素c的含量。

优选的，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6mm×250mm，5um，agilentzorbaxeclipseplusc18；

流动相：乙腈-0.03mol/l磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调节ph值至4-5），两者的体积比为10:90；

流动相：乙腈-缓冲盐水溶液；

检测波长：265-285nm；

柱温：25-45℃；

流速：0.8-1.2ml/min

更优选地：

检测波长：275nm；

柱温：30℃；

流速：0.8ml/min。

对照品溶液与供试品溶液的进样体积各为10μl；

检测器为dad检测器（二极管阵列检测器）；

高效液相色谱系统中维生素c峰理论塔板数不低于8000。

对照品溶液、供试品溶液优选的制备方法如下：

对照品溶液的制备：精密称取维生素c对照品置棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液溶解定容，制备成含维生素c对照品0.15mg/ml对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密量取含银杏叶提取物的注射剂适量置棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液稀释10倍，过滤，取续滤液作为供试品溶液；

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）本发明采用普通液相色谱仪、恒定流速洗脱、固定检测波长，可测定含银杏叶提取物注射液中维生素c的含量，色谱中各成分峰能达到良好的分离效果，测定结果准确，且操作简单，快捷，易于掌握。

（2）本发明紫外扫描维生素c对照品溶液的紫外吸收，维生素c在272±2nm附近有最大吸收；但其在265nm～285nm范围内液相图谱有较高的响应值，综合考虑以265-285nm为检测波长，进行含量测定。供试品进行简单的一步稀释，过滤后进样即可。外标法计算即得维生素c含量。

附图说明

图1实施例1中对照品溶液的高效液相色谱图；

图2实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；

图3实施例2中供试品溶液的高效液相色谱图；

图4实施例3中供试品溶液的高效液相色谱图；

图5对比例1中对照品溶液的高效液相色谱图；

图6对比例2中对照品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明的权利要求范围内所做的有限次的修改仍在本发明的权利要求范围内。

本发明所用维生素c对照品购于中国食品药品检定研究院。含银杏叶提取物的注射液为市售产品，如舒血宁注射液或银杏叶提取物注射液等。

实施例1

含银杏叶提取物的注射液中维生素c含量测定的方法，依次包括下述步骤。

1.仪器与试剂

（1）仪器：agilent高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，四元梯度泵

（2）试剂：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯；维生素c对照品；含银杏叶提取物的注射液。

2.实验条件

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc184.6×250mm5μm；流动相：乙腈-0.03mol/l磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调节ph值至4-5），两者体积比10:90；检测波长为275nm；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；理论板数按维生素c峰计算应不低于8000。

3．样品测定：

对照品溶液的制备：精密称取维生素c对照品适量，置棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液溶解定容，制成每1ml含维生素c0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取市售含银杏叶提取物的注射液1ml置10ml棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

4.方法学考察

（1）线性范围的考察

取对照品溶液，分别进样1、2、5、10、20、30μl测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，得标准曲线。

维生素c进样量在0.1491~4.4726μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=3055.5x+63.415，r=0.9998；结果见表1。

表1维生素c对照品测定结果

（2）精密度试验

精密吸取对照品溶液10μl重复进样6次，测得峰面积rsd＜2.0%。结果见表2。

表2精密度试验结果

（3）稳定性试验

取同一供试品溶液在室温下避光放置，间隔15min进样一次，结果维生素c峰面积rsd＜2.0%，表明75分钟内稳定。结果见表3。

表3稳定性试验结果

（4）重复性试验

取同一批样品分别平行制备6份供试品溶液，按照拟定的方法测定维生素c含量，结果见表4。

表4样品重复性试验

（5）回收率试验

取已知含量的样品，分别精密加入一定量的维生素c对照品，按供试品制备并拟定的含量测定方法测定，结果见表5。

表5维生素c回收率测定结果

（6）样品测定

取注射液按照前述方法制备供试品溶液，并按拟定方法测定。供试品溶液维生素c峰形对称，部分批次结果见表6。

表6样品含量测定结果

对照品溶液的高效液相色谱图见附图1，供试品溶液的高效液相色谱图见附图2，对照品溶液、供试品溶液的高效液相色谱中维生素c理论塔板数分别是15625、11243，供试品溶液中维生素c峰分离较好，不受注射液中其他成分的干扰。

实施例2

含银杏叶提取物的注射液中维生素c含量测定的方法，依次包括下述步骤。

1.仪器与试剂

（1）仪器：agilent高效液相色谱仪，紫外检测器，四元梯度泵

（2）试剂：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯。试剂：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯；维生素c对照品；含银杏叶提取物的注射液。

2.实验条件

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：kromasil100-5c184.6×250mm5μm；流动相：乙腈-0.1mol/l醋酸钠水溶液（用冰醋酸调节ph值至4-5），两者体积比1:99；检测波长为265nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；

3．样品测定：

对照品溶液的制备：精密称取维生素c对照品适量，置棕色量瓶中，加流动相溶解定容，制成每1ml含维生素c0.05mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取市售含银杏叶提取物的注射液2ml置10ml棕色量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品与供试品溶液各50μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定维生素c的含量。供试品溶液的高效液相色谱图见附图3，其中维生素c理论塔板数为9528。

实施例3

含银杏叶提取物的注射液中维生素c含量测定的方法，依次包括下述步骤。

1.仪器与试药

（1）仪器：agilent高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，四元梯度泵

（2）试药：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯。试剂：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯；维生素c对照品；含银杏叶提取物的注射液。

2.实验条件

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：theromosyncronisc18，4.6mm×150mm5μm；流动相：乙腈-0.02mol/l磷酸二氢钠水溶液（用磷酸调节ph值至4-5），两者体积比30:70；检测波长为285nm；柱温：35℃；流速：0.5ml/min；

3．样品测定：

对照品溶液的制备：精密称取维生素c对照品适量置棕色量瓶中，加1%草酸溶解定容，制成每1ml含维生素c0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取市售含银杏叶提取物的注射液15ml置200ml棕色量瓶中，加1%草酸定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各25μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定注射液中维生素c的含量。供试品溶液的高效液相色谱见附图4，其中维生素c理论塔板数为9614。

对比例1

已公开专利cn106645527a公布了一种测定长春西汀注射液中维生素c含量的检测方法。参照该专利公开的方法测定含银杏叶提取物的注射液中维生素c的含量，具体方法如下。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6mm×250mm，5um；乙腈-0.2mol/l醋酸铵水溶液（50:50）为流动相；检测波长为275nm。

对照品溶液的制备：取维生素c对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密置取注射液1ml置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定。

该技术提供方法测得的对照品溶液的高效液相色谱图见附图5所示。图5中，维生素c峰保留时间偏短，且峰形中有毛刺状突起。

对比例2含银杏叶提取物的注射液中维生素c含量测定的方法

1.仪器与试剂

（1）仪器：agilent高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，四元梯度泵

（2）试剂：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯。试剂：乙腈（色谱纯），纯化水，其它试剂均为分析纯；维生素c对照品；含银杏叶提取物的注射液。

2.实验条件

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc184.6×250mm5μm；流动相：乙腈-0.02mol/l磷酸二氢钾水溶液，两者体积比5:95；检测波长为275nm；柱温：30℃；流速：0.9ml/min；

3．样品测定：

对照品溶液的制备：精密称取维生素c对照品适量，置棕色量瓶中，加流动相溶解定容，制成每1ml含维生素c0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取市售含银杏叶提取物的注射液1ml置10ml棕色量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

该方法测定的对照品溶液的色谱图如附图6所示。图6中维生素c峰峰形相对圆滑，无毛刺状突起，但对称性稍差，其中维生素c理论塔板数为9600。