一种快速检测甲胎蛋白的方法与流程

本发明涉及样品浓度检测领域，具体涉及一种甲胎蛋白的快速检测方法。

背景技术：

原发性肝癌(primaryhepaticcancer，phc)是一种恶性肿瘤，据报道其不仅在我国发病率高，其在恶性肿瘤死亡率中占第二位。原发性肝癌的恶化速度特别快、治疗相对困难，并且治疗效果也不尽如人意，一旦发现病症，往往已经属于中期或者晚期。因此，对原发性肝癌的早期诊断的重要性不言而喻。在癌症的发病初期就及时的诊断出病症，对于提高癌症的治愈率、延长患者存活时间、减轻家庭和社会负担意义重大。

phc极易由肝病演化而来，目前肝癌早期诊断的临床血清学检验指标主要为甲胎蛋白(α-fetoprotein，afp)。甲胎蛋白是一种糖蛋白，它的分子量为69kda的。作为原发性肝癌的标记物之一，检测甲胎蛋白在血清中的含量，对于及时诊断原发性肝癌意义重大。在正常人体内，血清中甲胎蛋白的含量一般会低于20ng/ml，如果甲胎蛋白的含量有明显的升高，那么就极有可能患了肝肿瘤。

现有技术中关于甲胎蛋白的检测方法，需要通过较为繁琐的溶液配制，且结合、反应时间超过20小时(如cn103558396a)，所耗费的时间较长。因此，需要研究一种能够快速检测甲胎蛋白的方法。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题是，提供快速测定甲胎蛋白含量的分析方法。

本发明的技术方案是，一种快速检测甲胎蛋白的方法，具体实现方法为：

(1)未知样品处理：将单壁碳纳米管分散至质量浓度1-15％的高分子非离子表面活性剂的分散剂中，得到单壁碳纳米管分散液；单壁碳纳米管在分散溶剂中的浓度为0.5mg/ml～10mg/ml；

将得到单壁碳纳米管分散液与甲胎蛋白抗体均匀混合，形成单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物；

将单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物均匀涂覆至滤纸表面，将涂覆好的滤纸置于33-40℃烘箱烘干20-30小时，得到纸基传感器；

(2)标准曲线建立：将一系列浓度的甲胎蛋白标准样品滴至滤纸上，置于33-40℃烘箱烘干20-30小时，得到标准样品纸基传感器，测定其电阻值，记录一定时间内传感器电阻的变化，建立电阻值和甲胎蛋白浓度之间的标准曲线；

(3)未知样品定量检测：测定步骤(1)得到的纸基传感器的电阻值，将电阻值代入相应的标准曲线，即可计算未知样品甲胎蛋白的浓度。

低温下需要很长时间才能将滤纸完全烘干，如果不能完全烘干则会影响测定效果。

步骤(2)的“一定时间”指读数稳定的时间，一般需要0.5～1min。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，所述单壁碳纳米管为经羧基化(-cooh)修饰的单壁碳纳米管，其直径为0.5nm～2nm。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，单壁碳纳米管在分散溶剂中的浓度为1mg/ml～5mg/ml。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，单壁碳纳米管的分散溶剂浓度为1％～5％。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，所述分散剂选自泊洛沙姆溶液。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，步骤(2)和(3)所述电阻值用万用表测定。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，步骤(1)所述甲胎蛋白抗体与单壁碳纳米管分散液的比例为0.5-2μl：5-10ml。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，步骤(2)所述甲胎蛋白标准样品的浓度为5ng/ml～100ng/ml。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，步骤(1)所述滤纸为定性滤纸。

根据本发明的快速检测甲胎蛋白的方法，优选的是，步骤(1)所述涂覆为直接涂于滤纸上或者通过将复合物滴加至打印机墨盒中，通过打印机打印至滤纸上。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明的创新点是：

本发明利用甲胎蛋白与其抗体特异性结合的特点，根据抗体和抗原结合前后纸基碳纳米管传感器的电阻变化来实现检测。创造性地建立了一种以纸基碳纳米管传感器为平台，检测甲胎蛋白的方法，与常规分析手段比较，整个检测过程具有成本低、快速且易操作等优势。使得该方法对于相关疾病的及早诊断和预后具有重要意义。

附图说明

图1是采用打印法制备所得空白纸基碳纳米管传感器。

图2是采用涂覆法制备所得空白纸基碳纳米管传感器。

图3是甲胎蛋白检测装置图。

具体实施方式

实施例1

将羧基化的单壁碳纳米管分散至浓度为1％的泊洛沙姆溶液中，形成浓度为3mg/ml的分散液。将5ml单壁碳纳米管分散液与1μl甲胎蛋白抗体均匀混合，形成单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物。将单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物滴加至打印机墨盒中，待打印。同时，利用绘图软件设计纸基传感器检测区域。首先打印纸芯片的轮廓，而后打印疏水区域。最后将打印好的纸基传感器置于37℃烘箱24小时左右，得到纸基传感器(图1)。采用此方法得到的纸基传感器可以用来检测甲胎蛋白。

在尺寸为2cm×5mm的滤纸条上，将浓度为5ng/ml～100ng/ml的甲胎蛋白标准样品滴至滤纸条上，置于35℃烘箱烘干30小时，得到标准样品纸基传感器，并用万用表测定其电阻值，记录一定时间内传感器电阻的变化，建立电阻值和甲胎蛋白浓度之间的标准曲线y＝1.1906x+70.568(r2＝0.9829)。在纸传感器的反应区域滴加未知浓度的甲胎蛋白溶液，测出特异性免疫反应前后纸芯片的电阻变化值△r1，将△r1代入标准方程中计算，可以得到未知抗原的浓度(图3)

实施例2

将羧基化的单壁碳纳米管分散至浓度为2％的泊洛沙姆溶液中，形成浓度为5mg/ml的分散液。将5ml单壁碳纳米管分散液与1μl甲胎蛋白抗体均匀混合，形成单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物。将单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物涂覆至尺寸为2cm×5mm的滤纸条上。最后将涂覆好的纸基传感器置于37℃烘箱24小时左右，得到纸基传感器(图2)。采用此方法得到的纸基传感器可以用来检测甲胎蛋白。

在尺寸为2cm×5mm的滤纸条上，将浓度为5ng/ml～100ng/ml的甲胎蛋白标准样品滴至滤纸条上，置于38℃烘箱烘干25小时，得到标准样品纸基传感器，并用万用表测定其电阻值，记录一定时间内传感器电阻的变化，建立电阻值和甲胎蛋白浓度之间的标准曲线y＝1.1906x+70.568(r2＝0.9829)。在纸传感器的反应区域滴加未知浓度的甲胎蛋白溶液，测出特异性免疫反应前后纸芯片的电阻变化值△r1，将△r1代入标准方程中计算，可以得到未知抗原的浓度。

实施例3

将羧基化的单壁碳纳米管分散至浓度为5％的泊洛沙姆溶液中，形成浓度为7mg/ml的分散液。将6ml单壁碳纳米管分散液与1μl甲胎蛋白抗体均匀混合，形成单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物。将单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物滴加至打印机墨盒中，待打印。同时，利用绘图软件设计纸基传感器检测区域。首先打印纸芯片的轮廓，而后打印疏水区域。最后将打印好的纸基传感器置于37℃烘箱25小时左右，得到纸基传感器。采用此方法得到的纸基传感器可以用来检测甲胎蛋白。

在尺寸为2cm×5mm的滤纸条上，将浓度为5ng/ml～100ng/ml的甲胎蛋白标准样品滴至滤纸条上，置于37℃烘箱烘干30小时，得到标准样品纸基传感器，并用万用表测定其电阻值，记录一定时间内传感器电阻的变化，建立电阻值和甲胎蛋白浓度之间的标准曲线y＝1.1906x+70.568(r2＝0.9829)。在纸传感器的反应区域滴加未知浓度的甲胎蛋白溶液，测出特异性免疫反应前后纸芯片的电阻变化值△r1，将△r1代入标准方程中计算，可以得到未知抗原的浓度。

实施例4

将羧基化的单壁碳纳米管分散至浓度为8％的泊洛沙姆溶液中，形成浓度为8mg/ml的分散液。将8ml单壁碳纳米管分散液与0.8μl甲胎蛋白抗体均匀混合，形成单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物。将单壁碳纳米管-甲胎蛋白复合物涂覆至尺寸为2cm×5mm的滤纸条上。最后将涂覆好的纸基传感器置于36℃烘箱26小时左右，得到纸基传感器。采用此方法得到的纸基传感器可以用来检测甲胎蛋白。

在尺寸为2cm×5mm的滤纸条上，将浓度为5ng/ml～100ng/ml的甲胎蛋白标准样品滴至滤纸条上，置于38℃烘箱烘干24小时，得到标准样品纸基传感器，并用万用表测定其电阻值，记录一定时间内传感器电阻的变化，建立电阻值和甲胎蛋白浓度之间的标准曲线y＝1.1906x+70.568(r2＝0.9829)。在纸传感器的反应区域滴加未知浓度的甲胎蛋白溶液，测出特异性免疫反应前后纸芯片的电阻变化值△r1，将△r1代入标准方程中计算，可以得到未知抗原的浓度。

本发明的甲胎蛋白检测方法，操作简单，快速定量，成本低，利于推广。