本发明属于食品安全检测技术领域，涉及奶制品中残留黄曲霉素m1的检测方法。
背景技术：
牛奶、肉制品等动物源食品含有蛋白质、氨基酸、糖类、钙、磷、铁等丰富的营养物质，随着大众生活水平的不断提高，动物性食品在居民的饮食结构中占有的比例越来越大。乳品与乳制品在我国的消费量越来越大,且品种也越来越多样化。目前,随着一系列afm1污染事件被报道，人们对它的认识也逐渐深入。afm1危害人类最主要的方式就是通过乳及乳制品的摄入,所以乳及乳制品中afm1的污染控制极其重要。为了确保乳品市场上商品的安全,乳品中afm1快速检测显得尤为重要。
黄曲霉毒素m1(afm1)是黄曲霉毒素b1的羟化代谢产物，1963年由alleroft首先发现，1965年被命名为黄曲霉毒素m1。afm1主要存在于动物的可食部分，如肝脏、肌肉、血液等，也可以通过尿液和乳汁排出。黄曲霉毒素m1毒性很大，经乳制品摄入会对人体产生巨大的危害。它的熔点相当高，为299℃，在365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光；其理化性质很稳定，牛奶经过巴氏消毒，几乎不被破坏。afm1具有强致癌性和致基因突变性。afm1进入人体后，对血液、肝脏、肾脏、肌肉有不同程度的破坏,其中对肝脏和肾脏的危害最大。当与乙肝病毒共同作用于肝脏时形成倍乘风险效应，导致肝癌发生。另外,当婴幼儿乳品及母乳中含有afm1时，对婴幼儿健康会造成很大影响。可以造成发育迟缓、肾功能降低、肝细胞癌早发甚至可能导致急性中毒死。近年来，世界各国纷纷制定了乳与乳制品中afm1的限量标准。包括中国、美国和日本在内的许多国家规定奶及奶制品中afm1的含量不得超过0.5μg/kg。
用于食品中黄曲霉素m1残留检测的方法，基本上可以分为两大类型：一是现代仪器分析方法；二是免疫分析法。现代仪器分析方法一般采用色谱法，检测结果精确、敏感度高，但是需要繁琐的样本处理和大型设备，检测时间长，适合在实验室进行。免疫分析方法为抗原抗体的竞争性结合，其敏感度到、准确，并可根据需要开发高通量的试剂盒或快速定量检测试剂盒；在免疫分析方法中，免疫测定(fia)法作为相对独立的分析方法可以在食品加工、销售、消费等现场进行使用；同样，免疫分析方法与常规理化分析联用如免疫层析，与常规的理化分析技术相比，免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低，但一般用胶体金作为显色，灵敏度有待提高。荧光免疫层析技术是以荧光为标记示踪物，结合操作简单、速度快、分析成本低的免疫层析技术建立的高灵敏度的新型快速检测技术。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种生产工艺简单、操作简便、灵敏度高，能快速检测奶制品中黄曲霉素m1的残留试剂盒。快速检测黄曲霉素m1节约了监管和检测成本。
本发明提供一种检测奶制品中黄曲霉素m1残留的快速检测试剂盒，所述试剂盒由检测分析液和检测卡组成。
在一优选例中，所述的检测卡，其特征是：所述检测卡由塑料卡盒以及装入其中的试纸条组成。
在一优选例中，所述试纸条由基片、吸液部件、检测部件、加样部件组成，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和检测部件。
在一优选例中，所述的质控带和检测带，其特征在于，所述质控带设置在靠近加样部件一侧，且质控带上包被有抗兔igg抗体；所述检测带设置在靠近吸液部件一侧，且包被有黄曲霉素m1抗原。
在一优选例中，所述卡盒和试纸条，其特征是，由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和读卡窗口，所述试纸条完全设置于下盖中，所述加样窗口和读卡窗口分别对应于所述试纸条上的加样部件和质控带及检测带。
在一优选例中，所述的检测分析液，其特征是：所述检测分析液为荧光标记的黄曲霉素m1抗体和兔igg抗体，其中所述黄曲霉素m1抗体单克隆抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的膜条的结构示意图；其中，1指示基片；2指示吸液部件13指示检测部件；4指示加样部件；5指示质控带；6指示检测带
图2显示了本发明的黄曲霉素m1检测卡(装有膜条)的结构示意图；其中，1指示卡盒下盖；2指示卡盒上盖；3指示加样窗口；4指示加样部件；5指示读卡窗口；6指示质控带；7指示检测带；8指示检测部件；9指示产品编号区(ts)；10指示条形码识别区；
图3.检测黄曲霉素m1的标准曲线
图4.检测黄曲霉素m1阴性样本信号
图5.检测黄曲霉素m1阳性样本信号(0.5ug/kg)
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，将吸液部件、检测部件和加样部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带以及检测带，并且将吸液部件和检测部件以部分重叠的方式固定在检测部件两端，组装后放入塑料卡盒中，将制备的检测卡与检测分析液组成检测黄曲霉素m1检测试剂盒。从而能够以简单的生产工艺制得检测奶制品中黄曲霉素m1检测试剂盒，所述检测试剂盒操作简便，灵敏度高，适用于乳制品中黄曲霉素m1的快速检测。
本发明的磺胺类和四环素类检测试剂盒
本发明提供一种生产工艺简单、操作简便、灵敏度高、适用于乳制品中黄曲霉素m1的快速检测试剂盒。所述样品可以是奶粉或者鲜奶。
所述乳制品中黄曲霉素m1检测快速检测试剂盒由检测卡和检测分析液组成。所述检测卡由装有试纸条的塑料卡盒组成。所述试纸条包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其中，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定有吸液部件和检测部件，检测带包被有黄曲霉素m1抗原，而质控带上包被有抗兔igg抗体。
在优选的实施方式中，本发明的检测卡的试纸条中，两条检测带上所包被的黄曲霉素m1抗原为黄曲霉素m1与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白可以是bsa或者ova。
本文所述的“部分重叠的方式固定”表示相邻的两个部件形成一定的重叠区域，而非一个部件完全包含在另一部件中的完全重叠，并且该两部件通过该重叠区域而固定。例如，如附图1所示，加样部件(4)的右侧与检测部件的左侧(3)之间形成一定的重叠区域，两部件通过该重叠区域而固定。固定的方式可由本领域技术人员自主选择，例如通过粘合等方式。
在优选的实施方式中，所述检测分析液，包含标记有荧光染料的黄曲霉素m1抗体和兔igg抗体，所述检测分析液的溶剂部分是含有bsa的磷酸缓冲液，所述黄曲霉素m1抗体为单克隆抗体。所述检测分析液中的标记用荧光染料包括但不限于，fitc(fluorescein)、alexafluor647、cftm647、tritc(rhodamine)和calfluor(r)red610等。
基于上述检测卡和检测分析液，本发明提供了一种检测乳制品中黄曲霉素m1的快速检测试剂盒，所述试剂盒装有：
(a)本发明的黄曲霉素m1快速检测卡；
(b)本发明的检测分析液。
本发明的制备或实施方法
(1)黄曲霉素m1快速检测卡
a.用包被缓冲液稀释黄曲霉素m1抗原和抗兔抗体igg，将稀释后的两种抗原和一种抗体均匀地喷于作为检测部件的硝酸纤维膜上，抗原渗入硝酸纤维素膜后形成检测带；抗兔抗体igg的包被形成质控带。
b.在基片上分别依次粘贴上述硝酸纤维素膜、作为加样部件的玻璃纤维和作为吸液部件的吸水纸，形成检测试纸条，按照要求切割成适当宽度后装入塑料卡盒中最后形成快速检测卡。
(2)制备检测分析液
a.分别荧光标记黄曲霉素m1抗体和兔igg抗体。
b.用含有bsa的磷酸缓冲液将荧光标记后的抗体稀释配制成检测分析液。
本发明的优点
与现有相关检测技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1)本发明的生产工艺简单，且能快速检测乳制品中黄曲霉素m1残留，节省了检测成本；
2)本发明的操作简单，检测速度快(检测总时间10min)，采用荧光作为信号，与fcr小型荧光检测仪(例如，湖州申科生物科技有限公司生产)配套，增加了检测的灵敏度，实现了乳制品中黄曲霉素m1快速检测，节约了检测监管成本。
实施例1.制备本发明
(1)制备黄曲霉素m1快速检测卡(图1、图2)
a.用包被缓冲液(含有bsa的磷酸缓冲液)分别将黄曲霉素m1抗原和兔抗体igg稀释到适当浓度(0.4-2.0μg/μl)。在25±5℃的温度下，将稀释后的两种抗原及抗体均匀喷于硝酸纤维膜上，在12％-30％的湿度条件下烘干6小时左右，干燥保存备用；
b.在黑色pvc基片上分别依次粘贴步骤a所得到的包被好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水纸形成检测卡，按照要求切割成适当宽度。
c.将步骤b所得到的检测卡装入卡盒的下盖中，盖上上盖，形成完整的带卡盒检测卡。
(2)制备检测分析液
a.按照常规方法分别荧光标记黄曲霉素m1抗体和兔igg抗体。
b.将荧光标记后的抗体用含有bsa的磷酸缓冲液稀释配制成检测分析液。
实施例2.乳制品中黄曲霉素m1残留的检测
乳粉：称取1g试样(精确至0.01g)，用70％甲醇将其慢慢溶解，定容至10ml，加入0.2g氯化钠，吸取液体稀释2倍后用于检测。乳：取3.0ml牛奶试样，加入0.2g氯化钠后混溶，加入7ml甲醇混合，7000转/分钟下离心10min，小心移取用于分析的乳底脱脂层，不要碰触顶部脂肪层，吸取液体稀释2倍后检测。将待检测的乳制品提取液200μl加入50μl检测分析液中，混合后取出150μl的混合液，加入实施例1所得卡盒的加样窗口，反应10min后用fcr荧光检测仪(湖州申科生物科技有限公司)读取两条检测带和质控带处的荧光信号，通过比较检测带和质控带的荧光信号以及仪器内置的cutoff值计算并获得样本中黄曲霉素m1的阴阳性结果(图4、图5)。
实施例3.黄曲霉素m1残留快速检测试剂盒特异性及灵敏度
使用经过国标法验证的黄曲霉素m1阴性样本，分别添加黄曲霉素m2、g1、g2、b1和b2标准品于影响样本中。配制一系列浓度梯度的阳性样本，使用黄曲霉素m1快速检测试剂盒分别检测。结果如表4所示，黄曲霉素m1检测试剂盒与相关黄曲霉素m2、g1、g2、b1和b2无交叉反应小于0.1％。
使用黄曲霉素m1阴性样本、以及黄曲霉素m1标准品，配制一系列浓度梯度：0ng/ml、0.0049ng/ml、0.0098ng/ml、0.0195ng/ml、0.039ng/ml、0.78ng/ml、0.156ng/ml、0.3125ng/ml和0.625ng/ml。取200μl系列标准品与50μl的检测分析液均匀混合后，取150μl加入到检测卡的加样窗口，反应15min后，在fcr系列单通道荧光免疫分析仪上读数，根据样本的t线信号值与c线信号比值(t/c值)与标准品浓度建立标准曲线(表1、图3)。重复检测20个0ng/ml浓度的标准品(表3)，计算均值(x)、标准差(sd)和x-2*sd.灵敏度的计算公式如下：灵敏度＝计算的x-2*sd值作为y值代入标准曲线方程(表2)中求的的x值(ng/ml)。结果如图3所示，其灵敏度为0.02ng/ml。
表1检测黄曲霉素标准曲线数据
表2.检测黄曲霉素标准曲拟合方程
表3.重复检测20个0ng/mlafm1样本的实验数据
表4黄曲霉素m1检测试剂盒与相关黄曲霉素的交叉反应率