本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种血红素的检测方法，特别是涉及一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼光谱的血红素的检测方法及其应用。
背景技术：
血红素是重要的天然金属卟啉配合物，是生物体中血红蛋白和肌红蛋白等的活性中心，并且作为一种天然色素、铁强化剂和抗贫血药，具有重要的生理作用和很高的实用价值，被广泛地应用在食品工业、医药保健领域，是目前公认的吸收率最高、效果最好的生物铁剂。
在常规的血液检测中，除了检测血糖和胆固醇之外，血红素也是一项重要的生化检测标准，并且在血红素的工业化生产中也需要检测其含量来控制产品质量，因而研究者们也越来越重视血红素的检测。目前，检测血红素的方法主要有比色法、紫外分光光度法、电化学方法以及hplc法等。但这些方法具有操作步骤复杂、操作误差较大、测定结果准确度低等问题。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼光谱的血红素的检测方法，该方法将枝状金纳米结构应用于血红素的检测，建立一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼作用的血红素检测的新方法，所述方法能够快速、有效的检测血红素，并且具有灵敏度高、操作简单、成本低廉等优点。
本发明还提供一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼光谱的血红素的检测方法的应用。
技术方案：为了实现是上述目的，如本发明所述一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼光谱的血红素的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制枝状金纳米结构溶液：将金纳米结构分散在乙醇溶液中，得到金纳米结构分散液a；
(2)配制血红素溶液：将血红素溶解在二甲基亚砜中，并用稀释，得到不同浓度的血红素溶液b；
(3)制备标准样品：将金纳米结构分散液a和血红素母液b混合搅拌，然后离心分离，移去上清液，将下层沉淀物分散到乙醇溶液中，取分散液晾干，得到含有不同浓度血红素的标准样品；
(4)建立枝状金纳米结构检测血红素的标准曲线：通过拉曼光谱仪检测步骤(3)所制备的标准样品的拉曼光谱，并记录其拉曼光谱特征峰信号i；最后将所得到的i与步骤(3)所得不同浓度的标准样品的血红素浓度的自然数对数值绘制成i-lnc标准曲线，采用线性回归法得到i-lnc线性回归方程，建立基于枝状金纳米结构的表面增强拉曼作用的血红素检测方法；
(5)检测待测样品中血红素的浓度：将待测样品与步骤(1)中配制的金纳米结构溶液混合搅拌，然后离心分离，移去上清液，将下层沉淀物分散到乙醇溶液中，取分散液晾干，按照与步骤(4)相同的方法检测其拉曼光谱，根据拉曼光谱特征峰的强度i，由步骤4)中得到的标准曲线，计算出待测样品中血红素的含量。
其中，步骤(1)所述金纳米结构为枝状，其粒径大小为50～60nm。可以采用现有技术中已知的方法合成。有关枝状金纳米粒子的合成，可参见文献(kumar,p.s.；pastoriza-santos,i.；rodríguez-gonzález,b.；garcíadeabajo,f.j.；liz-marzánl.m.；high-yieldsynthesisandopticalresponseofgoldnanostars,nanotechnology,2008,19,015606(6pp)。
作为优选，步骤(1)所配制的金纳米结构分散液a中，枝状金纳米粒子的浓度为50～150μg/ml。
进一步地，步骤(2)所配制的血红素溶液b中，血红素的摩尔浓度为0.075～1.50mmol/l。
其中，所述步骤(3)混合搅拌为磁力搅拌时间为12-24h。
进一步地，所述下层沉淀物分散到乙醇溶液中枝状金纳米粒子的浓度为100～300μg/ml，所述不同浓度血红素的标准样品的血红素的浓度为0.05～1.20mmol/l。
作为优选，步骤(4)所述拉曼光谱仪的激发波长为514nm,功率是10mw，积分时间是60ms。
作为优选，步骤(4)所述中选择1622nm波长处的拉曼峰作为定量分析特征峰。
本发明所述的基于枝状金纳米结构表面增强拉曼光谱的血红素的检测方法在检测人类红细胞中血红素的浓度中的应用。
机理：本发明首先利用种子生长法制备了枝状结构的金纳米粒子；将其与血红素作用，通过评价所制备的枝状金纳米结构对血红素的表面增强拉曼作用，发现枝状金纳米结构对血红素的拉曼信号具有很好的增强作用，从而提出一种采用表面增强拉曼光谱法对血红素进行定量分析的方法。
本发明方法采用枝状金纳米结构为拉曼基底，当加入金纳米结构后，血红素的拉曼信号会明显增强，而其中特征峰强度与血红素的含量有关，从而以所述的枝状金纳米结构为拉曼基底，可以采用表面增强拉曼光谱法对血红素进行定量检测。金纳米结构具有独特的光学和电学性质以及良好的生物相容性，可安全用于生物检测领域。
有益效果：与现有技术相比，本发明根据本发明的基于表面增强拉曼光谱的高铁血红素的检测方法，将枝状金纳米结构应用于血红素的检测，建立一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼作用的血红素检测的新方法，所述方法能够快速、有效的检测血红素，并且具有灵敏度高、操作简单、成本低廉等优点。
具体具有如下优点：
1、本发明方法所采用的枝状金纳米结构与其他形貌的金属纳米粒子相比，具有更强的表面增强拉曼作用，且与血红素具有更好的生物相容性，更适用于生化检测。
2、本发明的方法中，采用的枝状金纳米结构不需要进行额外修饰，不需要使用价格比较昂贵、连接步骤繁琐的有机或生化材料进行前处理，因此操作简单。
3、本发明通过表面增强拉曼光谱可以实现血红素快速，高效的检测。
4、本发明对血红素的检测方法，其线性范围为0.05～1.20mmol/l；检测限为0.02mmol/l，检测范围宽，检测限低。
附图说明
图1为本发明制备的枝状金纳米粒子的透射电镜图；
图2为本发明中血红素浓度检测的标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
枝状金纳米结构的制备和溶液配制
1、枝状金纳米结构的制备
本实施例利用种子生长法合成枝状金纳米结构。具体方法是：称取5g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于25mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，取其中15mlpvp-dmf溶液磁力搅拌，迅速加入85μl2％(wt.)的氯金酸溶液和43μlpvp包裹的金种子，继续磁力搅拌1h。待反应完全后，将产物离心洗涤，金纳米颗粒结构为枝状结构，其粒径大小为50～60nm。
2、配制枝状金纳米结构溶液：将上述合成的枝状金纳米粒子分散在乙醇溶液中，得到金纳米结构溶液，其中枝状金纳米结构浓度为100μg/ml。
3、配制血红素溶液：将血红素溶解在dmso中，并用稀释液(体积比为66.5％乙醇、17％醋酸和16.5％纯水混合液)稀释得到一系列浓度的血红素溶液，浓度分别为0.075mmol/l，0.15mmol/l，0.30mmol/l，0.60mmol/l，1.20mmol/l，1.50mmol/l。
实施例2
枝状金纳米结构的表面增强拉曼作用评价
通过拉曼光谱仪检测枝状金纳米结构对血红素的表面增强拉曼作用；其中激发波长为514nm，功率为10mw，选取波长1622nm处的信号为分析对象。取20μl实施例1中浓度为1.20mmol/l的血红素溶液，滴到洁净的玻璃片上，晾干，测定其拉曼光谱；取2.0ml实施例1中配制的枝状金纳米结构溶液和1.0ml浓度为1.50mmol/l的血红素溶液混合，磁力搅拌12h，离心分离，移去上层清液，将下面沉淀物分散到1.0ml乙醇溶液中，超声分散，其中，金纳米结构的浓度为200μg/ml，血红素的浓度为1.20mmol/l，移取其中20μl滴在洁净的玻片上，晾干，通过拉曼光谱仪检测其拉曼光谱。结果表明在加入200μg/ml枝状金纳米粒子后，血红素的拉曼信号明显增强，说明枝状金纳米结构对血红素具有良好的表面增强拉曼作用。
实施例3
建立枝状金纳米结构检测血红素浓度的标准曲线
分别取2.0ml步骤实施例1中配制的金纳米结构分散液和1.0ml血红素母液，混合，磁力搅拌12h，离心分离，移去上层清液，将下层沉淀物分散到1.0ml乙醇溶液中，超声分散，其中枝状金纳米粒子的浓度为200μg/ml，血红素的浓度分别为0.05mmol/l，0.10mmol/l，0.25mmol/l，0.50mmol/l，1.00mmol/l，1.20mmol/l，。取其中20μl滴到洁净的玻璃片上，晾干，得到含有不同浓度血红素的标准样品；利用拉曼光谱仪检测所制备标准样品的拉曼光谱，记录拉曼光谱特征峰信号i，将所得到的i与血红素浓度的自然数对数绘制成i-lnc标准曲线(如图2所示)，采用线性回归法得到i-lnc线性回归方程为i＝731lnc-2235。据此建立拉曼特征峰强度和血红素浓度自然数对数的标准曲线，其线性范围为0.05～1.20mmol/l，检测限为0.02mmol/l。
实施例4
为了验证本发明的一种基于枝状金纳米结构表面增强拉曼光谱的血红素的检测方法，在相同实验条件下，模拟一个含血红素的样品。取2.0ml实施例1所配制的枝状金纳米结构和1.0ml待检测的样品，混合，磁力搅拌12h，离心分离，移去上层清液，将下面沉淀物分散到1.0ml乙醇溶液中，超声分散；其中，金纳米结构的浓度为200μg/ml。移取其中20μl滴在洁净的玻片上，晾干，通过拉曼光谱仪检测其拉曼光谱。根据实施例3建立的标准曲线，计算得到待测样品中血红素含量约为0.83mmol/l，与血红素本来的浓度(0.80mmol/l)相当，由此可见，本发明的检测方法测量结果可靠。
实施例5
实施例5的检测方法与实施例1-5相同，不同之处在于：实施例1所配制的金纳米结构分散液中，枝状金纳米粒子的浓度为50μg/ml；实施例2中混合液磁力搅拌时间为24h，超声分散后其中枝状金纳米粒子的浓度为100μg/ml。
实施例6
实施例6的检测方法与实施例1-5相同，不同之处在于：实施例1所配制的金纳米结构分散液中，枝状金纳米粒子的浓度为150μg/ml；实施例2中混合液磁力搅拌时间为12h，超声分散后其中枝状金纳米粒子的浓度为300μg/ml。