本发明涉及一种中药的炮制方法，具体涉及酒地黄的炮制工艺的筛选方法。
背景技术
地黄为玄参科植物地黄rehmanniaglutinosalibosch.的新鲜或干燥块根，生地炮制成熟地后药性由寒性转变为温性，作用由清转化为补，味由苦转甜。生地黄具有清热凉血，养阴生津的作用，熟地黄则具有滋阴补血的作用，汉代有蒸后取汁法，南北朝有蒸焙，隋唐时期有酒拌蒸、蒸爆九遍、酒炒等方法，宋代有炒炭、醋炒、生姜同炒等法。酒制是熟地黄传统炮制方法之一，依据古法记载炮制时要求达到“九蒸九晒”，才能够得到质量上乘的熟地药材。现今据不完全统计市面上销售的熟地黄在加工炮制时工艺多有改变，尤其是在辅料的使用上及炮制时间上，且大多都会简化工艺。多数仅以“黑如漆，甜如饴”等笼统的性状变化作为达到炮制终点的标准，并没有客观的质量检测标准。
本发明在熟地黄“九蒸九晒”炮制过程中的不同时间节点进行取样研究，采用hplc技术对熟地黄中含有的梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷d以及益母草苷四种活性成分进行含量测定，优选出最佳的酒地黄的炮制工艺。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种酒地黄的炮制工艺的筛选方法，该为熟地黄的炮制加工提供科学依据。对控制熟地黄的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种酒地黄的炮制工艺的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：酒地黄的炮制
取生地黄药材，第一天洗净外表泥沙，晒干备用，称取黄酒拌匀，装罐密封闷润24小时；第二天，将药材放入锅中隔水蒸；第三天，将药材置于日光下放晾晒干，完成一蒸一晒的炮制过程；如此再反复八次，一共完成九蒸九晒的炮制的全过程；炮制过程中，每一次蒸晒留取部分熟地黄留作为分析的样品；
步骤2：供试品溶液的制备
取九次蒸晒炮制后的熟地黄样品，分别置于烘箱中干燥，冷却，打粉过筛；精密称取熟地黄粗粉，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇，超声处理后取出放至室温，重新称定重量，用50％甲醇补足失重，取上清液，离心，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得九次蒸晒炮制后的熟地黄供试品溶液，于4℃保存备用；
步骤3：对照品溶液的制备
分别取毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，加甲醇配成对照品储备液，置4℃冰箱备用；分别精密吸取上述对照品溶液适量加甲醇定容，制成毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷的混合对照品溶液；
步骤4：回归方程的建立
分别精密吸取步骤3的混合对照品溶液2，5，10，15，20，25μl注入液相色谱仪，记录峰面积，以色谱峰面积y对进样量x进行线性回归，结果显示都有良好的线性关系；
步骤5：含量测定
分别精密吸取九次蒸晒炮制后的熟地黄供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录峰面积，根据步骤4的回归方程计算熟地黄供试品溶液中的毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷的含量。
作为优选方案，以上所述的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，
步骤1：
第一天将3批药材分别取样300g，进行编号，并洗净外表泥沙，晒干备用。后称取150g黄酒拌匀，装罐密封闷润24小时。第二天，分别将3批药材入锅隔水蒸8小时，设置水温为100℃。第三天，将3批药材置于日光下放晾晒干，以此为“一蒸一晒”的炮制过程。如此反复八次，一共完成九蒸九晒的炮制的全过程；炮制过程中，每一次蒸晒留取部分熟地黄留作为分析的样品。
作为优选方案，以上所述的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，
步骤2：供试品溶液的制备
取九次蒸晒炮制后的熟地黄样品各50g，置于80℃烘箱中干燥8小时，放入干燥器内冷却，打粉过24目筛备用；精密称取粗粉2.0g，置于50ml具塞锥形瓶中，加入精密量取的50％甲醇25ml，超声处理1h，功率300w，频率40hz，取出放至室温，重新称定重量，用50％甲醇补足失重，取上清液5ml，8000rpm离心10min，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得九次蒸晒炮制后的熟地黄供试品溶液，于4℃保存备用。
作为优选方案，以上所述的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，步骤3：对照品溶液的制备
分别取毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为498μg/ml、494μg/ml、486μg/ml、650μg/ml的对照品储备液，置4℃冰箱备用；分别精密吸取上述对照品溶液适量加甲醇定容至10ml，制成每1ml含毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷为49.80μg、98.80μg、97.20μg、130.0μg的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，步骤4和步骤5的色谱条件为：
kromasil100-5c18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，流动相乙腈和0.1％磷酸水；梯度洗脱：0～5min，2％a；5～20min，20％a；20～25min，30％a；25min～40min，30％a；40～45min，2％a；45～50min，2％a，检测波长203/334nm，柱温35℃，进样量20μl。
作为优选方案，以上所述的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，步骤4建立的毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷回归方程为：
工艺筛选实验：
本发明首次展开对古法炮制熟地黄在不同炮制时间节点的化学成分进行研究，对“九蒸九晒”炮制过程中以毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d以及益母草苷四种活性成分的含量变化进行了较为系统的对比研究，为地黄炮制工艺研究提供了科学依据。
在考察毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d以及益母草苷四种被测成分与杂质峰的分离情况时，先在预实验中比较了乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-水三种流动相的梯度洗脱效果，结果显示以乙腈-0.1％磷酸水为流动相峰形较好、分离度高、基线平稳，因此最终选择乙腈-0.1％磷酸水为流动相。
本发明筛选实验发现毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷四种指标性成分的最大吸收波长分别为334nm、203nm、203nm以及210nm，在预实验中在发现毛蕊花糖苷含量在波长203nm处偏低，与最大吸收波长334nm下有明显差异，且梓醇、地黄苷d和益母草苷在334nm波长下几乎没有被吸收，益母草苷含量在最大吸收波长210nm和203nm下没有明显差异，因此选择203nm作为梓醇、地黄苷d和益母草苷三种成分的检测波长，334nm作为毛蕊花糖苷的检测波长。
本发明在样品前处理中，分别对提取方式(超声、加热回流)、提取溶剂(25％甲醇，50％甲醇，100％甲醇、乙腈)、提取时间(30，60，90min)、取样量(0.5、1.0、2.0g)进行了考察，结果表明加热回流制成的供试品溶液重复性>3％，初步判断误差出现于蒸干程度的判定，导致部分供试品溶液浓度较大，部分供试品溶液浓度就较小，故此方法不可采取。由于超声操作简便，可行性高，故采取超声的方法提取。
在对不同提取溶剂进行考察时，不同浓度的甲醇提取含量差异小，而用乙腈提取时出现较多杂质峰，最后选择浓度为50％的甲醇作为提取溶剂。
在对提取时间进行考察时，提取时长30min处化学成分提取不完全，提取时间60min和90min差异较小，故选择提取时长为60min。
在对取样量进行考察时，结果显示取样量为0.5g及1.0g时四种指标性成分响应值较低，故选择取样量为2.0g。
通过以上筛选实验，最终选择2.0g样品粉末中加入50％甲醇25ml，超声处理60min为本实验供试品溶液制备的方法。
有益效果：
1、本发明提供的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，以熟地黄的活性成分为指标，并通过优选的含量测定方法筛选出最佳的炮制加工方法，整个工艺方法，可操作性强，可为熟地黄的炮制加工提供科学依据，对控制熟地黄的质量和保证临床疗效具有重要意义。
2、本发明提供的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为混合对照品溶液在203nm下的色谱图。
图2为酒地黄供试品在203nm下的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所用仪器
日本岛津公司shimadzulc-20ab高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器prominencesil-20a，二极管阵列检测器spd-m20a和柱温箱cto-20a；me204e电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司，精确到十万分之一)；bsm220.4分析天平(上海卓精公司，精确到万分之一)；方盘电子秤(英衡公司，精确到百分之一)；dsx-18l高压灭菌锅(上海申安器材有限公司)；gvs型超声波清洗器(深圳市够威科技有限公司)；dy-20流水式中药打粉机(温岭市奥力中药器械有限公司)；dhg-9140a型立式电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏器材有限公司)。
以下实施例所用试药
毛蕊花糖苷对照品(批号61276-17-3，纯度≥98％)、益母草苷对照品(批号52949-83-4，纯度≥98％)、地黄苷d对照品(批号81720-08-3，纯度≥98％)、梓醇对照品(批号2415-24-9，纯度≥98％)均购自南京森贝伽生物科技有限公司。三批地黄样品分别购自河南省永鑫堂中药饮片科技有限公司、安徽沪谯中药有限公司以及浙江桐君堂中药饮片有限公司。经南京海源中药饮片有限公司中药师丁斐鉴定为玄参科植物地黄(rehmanniaglutinosalibosch)的干燥根茎。乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。gb/t13662黄酒(购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司)。
1、一种酒地黄的炮制工艺的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：酒地黄的炮制
第一天将3批药材分别取样300g，进行编号，并洗净外表泥沙，晒干备用。后称取150g黄酒拌匀，装罐密封闷润24小时。第二天，分别将3批药材入锅隔水蒸8小时，设置水温为100℃。第三天，将3批药材置于日光下放晾晒干，以此为“一蒸一晒”的炮制过程。如此反复八次，一共完成九蒸九晒的炮制的全过程；炮制过程中，每一次蒸晒留取部分熟地黄留作为分析的样品；
步骤2：供试品溶液的制备
取九次蒸晒炮制后的熟地黄样品各50g，置于80℃烘箱中干燥8小时，放入干燥器内冷却，打粉过24目筛备用；精密称取粗粉2.0g，置于50ml具塞锥形瓶中，加入精密量取的50％甲醇25ml，超声处理1h，功率300w，频率40hz，取出放至室温，重新称定重量，用50％甲醇补足失重，取上清液5ml，8000rpm离心10min，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得九次蒸晒炮制后的熟地黄供试品溶液，于4℃保存备用；
步骤3：对照品溶液的制备
分别取毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为498μg/ml、494μg/ml、486μg/ml、650μg/ml的对照品储备液，置4℃冰箱备用；分别精密吸取上述对照品溶液适量加甲醇定容至10ml，制成每1ml含毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷为49.80μg、98.80μg、97.20μg、130.0μg的混合对照品溶液；
步骤4：回归方程的建立
分别精密吸取步骤3的混合对照品溶液2，5，10，15，20，25μl注入液相色谱仪，记录峰面积，如图1，以色谱峰面积y对进样量x进行线性回归，结果显示都有良好的线性关系；
步骤5：含量测定
分别精密吸取九次蒸晒炮制后的熟地黄供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录峰面积，如图2，根据步骤4的回归方程计算熟地黄供试品溶液中的毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷的含量。
以上所述的酒地黄的炮制工艺的筛选方法，步骤4和步骤5的色谱条件为：
kromasil100-5c18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，流动相乙腈和0.1％磷酸水；梯度洗脱：0～5min，2％a；5～20min，20％a；20～25min，30％a；25min～40min，30％a；40～45min，2％a；45～50min，2％a，检测波长203/334nm，柱温35℃，进样量20μl。
步骤4建立的毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷d和益母草苷回归方程如下表1：
表1回归方程
实施例2方法学考察
1、精密度试验
精密吸取上述实施例1的混合对照品溶液，按上述实施例1的色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。测得毛蕊花糖苷峰面积rsd为0.27％，梓醇峰面积rsd为0.55％，地黄苷d峰面积rsd为1.07％，益母草苷峰面积rsd为0.77％。四种指标性成分对照品溶液rsd值均小于3％，结果表明本试验仪器精密度良好。
2、重复性考察
精密称取同一批熟地黄样品粉末6份，按实施例步骤2的方法制备样品溶液，分别测定，记录色谱图，结果显示毛蕊花糖苷rsd为1.29％，梓醇rsd为1.15％，地黄苷drsd为1.88％，益母草苷rsd为2.44％。各样品rsd值均小于3％，结果表明本试验方法重复性良好。
3、稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液，按上述实施例1的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录四个成分的峰面积积峰值，结果显示毛蕊花糖苷rsd为2.56％，梓醇rsd为0.95％，地黄苷drsd为1.78％，益母草苷rsd为2.48％。各样品rsd值均小于3％，结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
4、加样回收率试验
分别精密称取来自同一批熟地黄6份样品粉末2.0g，分别置于锥形瓶中，精密加入适量的对照品，使得样品溶液中分别含有毛蕊花糖苷300.0μg，梓醇600.0μg，地黄苷d900.0μg，益母草苷1000μg。按照3.2.2项下方法制备供试品溶液，按上述实施例1的色谱条件测定，计算各成分的平均回收率以及rsd，表明稳定性好，具体见表2。
表2熟地黄中四个指标性成分的加样回收率试验
实施例3
1、样品测定
取来自不同产地的3批炮制完成的熟地黄粉末，分别称取粉末2g，精密称定，按实施例1下处理方法制备样品溶液，并按实施例1下色谱条件测定，计算含量见表3、表4、表5。
表3熟地黄药材(河南)含量测定(mg·g-1)
表4熟地黄药材(安徽)含量测定(mg·g-1)
表5熟地黄药材(浙江)含量测定(mg·g-1)
以上实验结果表明，梓醇、地黄苷d以及益母草苷含量随着蒸制次数的增加而呈现不同程度的下降。初步判断因梓醇、地黄苷d以及益母草苷都属于环烯醚萜苷类化合物，且环烯醚萜类化合物普遍极性较大，易溶于水且热稳定性差。其在加热过程中的降解程度主要与糖的数目相关，三糖苷几乎不降解，二糖苷降解部分，而单糖苷几乎全部降解。考虑因梓醇和益母草苷是单糖苷，热稳定性差，故这两种成分随着蒸制次数增加，含量明显下降且幅度较大。地黄苷d含量随着蒸制次数增加虽有下降，但在“五蒸五晒”后趋于稳定。毛蕊花糖苷属于苯乙醇苷类化合物，结果表明其在“六蒸六晒”时含量达到最大值，随着蒸制次数的增加后含量有所下降。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。