本发明涉及人工关节置换术技术领域，更为具体地，涉及一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法。
背景技术
关节置换术采用金属、高分子聚乙烯、陶瓷等材料，根据人体关节的形态构造等制成人工关节假体，并通过外科技术植入人体内代替患病关节。人工关节置换术是治疗骨关节疾病的有效方法，是关节终末期疾病和老年股骨颈骨折的重要治疗手段。但是，人工关节材料、手术方式、患者个体因素等均会影响人工关节的使用寿命。导致人工关节使用寿命较短的原因有很多，归结起来主要有机械因素和生物因素。其中，生物学因素主要是人工关节磨损产物(金属颗粒、金属离子等)会刺激炎性细胞分泌溶骨性因子如tnf-α、il-6等，溶骨性因子刺激骨细胞产生骨溶解，导致假体无菌性松动。目前一般在10～15年之间，就不得不进行人工翻修。
关节置换术是世界上最成功的矫形外科手术之一，旨在提升患者的生活质量。随着社会发展和人口老龄化进程加速，越来越多的患者选择关节置换术。假体无菌性松动是该手术主要并发症，也是造成致残率高和花费昂贵的真正原因。因此，植入物无菌性松动属于医学领域研究的热点和难点问题。
假体的无菌性松动，受到多因素影响。假体周围骨溶解导致的无菌性松动是人工关节置换术后最常见的失败原因之一，目前对人工关节无菌性松动的具体发生机制尚不完全清楚，可能是由多种因素，如磨损颗粒、金属离子、微动、应力遮挡、高液体压力等因素引起，磨损产物诱导的假体周围骨溶解被认为是造成假体无菌性松动的主要原因。
假体无菌性松动的早期诊断有利于早期治疗，现有的检测方法依赖于影像学检测手段进行早期诊断，例如x射线、ct扫描等。x射线检查是评价假体周围骨溶解和假体松动的重要方法，但对于无明显骨溶解征象的假体松动一般难以做出诊断。假体无菌性松动目前仅依靠影像学检查及出现了临床症状才进行诊断和严重程度评估，敏感度不够高，准确度低，不能满足临床诊断需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，敏感度高，对早期诊断无菌性假体松动具有重要临床价值，能半定量检测骨溶解情况，对患者的创伤小，操作方便快捷，结果分析简单，良好的临床推广应用价值，对于指导临床治疗具有重要意义。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养6～15d后，滴加酶，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养24～30h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养24～30h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养48～60h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；
s3、分别检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
优选的，步骤s1中所述酶为抗酒石酸酸性磷酸酶。
优选的，步骤s2中，所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为10～15mg/l，crcl3溶液的浓度为15～20mg/l。
优选的，步骤s2中，所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为11～14mg/l，crcl3溶液的浓度为16～18mg/l。
优选的，步骤s2中，所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为13mg/l，crcl3溶液的浓度为17mg/l。
优选的，步骤s3中，采用rank试剂盒、opg试剂盒分别检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量。
优选的，步骤s4中，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例。
优选的，步骤s5中，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例。
本发明的有益效果是：
(1)cd14+cd16+单核细胞作为炎性单核细胞，其在人体所占比例虽然不高，但是研究表明在炎症反应中会发挥重要作用，在本方案中采用流式细胞检测仪检测正常人外周血cd14+cd16+单核细胞比例，并将其作为评判骨溶解情况的一个指标，相比于其他耗时、复杂的免疫检测，能在较短的时间内通过简单的方法获取到判断假体无菌性松动骨溶解情况的一个重要指标，提高了检测效率，这对于早期诊断无菌性假体松动具有重要临床价值；并且，由于rankl/rank/opg信号通路是调节破骨细胞分化与成熟的主要通路，本方案获取rank/opg的比值作为判断假体无菌性松动骨溶解情况的另一个重要指标，结合cd14+cd16+单核细胞比例指标，提高了骨溶解情况的判断准确度，并通过设置多组已知浓度比例cocl2溶液及crcl3溶液进行干预，分别检测干预组与非干预组的rank/opg比值，能够半定量检测骨溶解情况，敏感度高，致残率低，花费成本低，提高了患者的生活质量。
(2)本发明获取多个对假体无菌性松动有重要影响作用的指标，能早期诊断人工关节术后假体无菌性松动，对患者的创伤小，操作方便快捷，结果分析简单，良好的临床推广应用价值，对于指导临床治疗具有重要意义。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。本说明书中公开的所有特征，或隐含公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
下面将详细描述本发明的具体实施例，应当注意，这里描述的实施例只用于举例说明，并不用于限制本发明。在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解，阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的技术。
实施例1
一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养12d后，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶，染色，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养28h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养28h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养52h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为13mg/l，crcl3溶液的浓度为17mg/l；
s3、分别采用rank试剂盒、opg试剂盒检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
最后，通过先判断步骤s3中计算的rank/opg的比值是否超过正常值，再判断步骤s4和s5，根据步骤s1作骨溶解定性判断，根据步骤s3、s4、s5作骨溶解定量判断。
实施例2
一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养15d后，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶，染色，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养24h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养26h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养60h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为10mg/l，crcl3溶液的浓度为15mg/l；
s3、分别采用rank试剂盒、opg试剂盒检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
最后，通过先判断步骤s3中计算的rank/opg的比值是否超过正常值，再判断步骤s4和s5，根据步骤s1作骨溶解定性判断，根据步骤s3、s4、s5作骨溶解定量判断。
实施例3
一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养8d后，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶，染色，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养30h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养25h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养48h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为15mg/l，crcl3溶液的浓度为18mg/l；
s3、分别采用rank试剂盒、opg试剂盒检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
最后，通过先判断步骤s3中计算的rank/opg的比值是否超过正常值，再判断步骤s4和s5，根据步骤s1作骨溶解定性判断，根据步骤s3、s4、s5作骨溶解定量判断。
实施例4
一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养13d后，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶，染色，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养28h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养30h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养60h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为11mg/l，crcl3溶液的浓度为16mg/l；
s3、分别采用rank试剂盒、opg试剂盒检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
最后，通过先判断步骤s3中计算的rank/opg的比值是否超过正常值，再判断步骤s4和s5，根据步骤s1作骨溶解定性判断，根据步骤s3、s4、s5作骨溶解定量判断。
实施例5
一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养14d后，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶，染色，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养24h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养29h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养55h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为14mg/l，crcl3溶液的浓度为18mg/l；
s3、分别采用rank试剂盒、opg试剂盒检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
最后，通过先判断步骤s3中计算的rank/opg的比值是否超过正常值，再判断步骤s4和s5，根据步骤s1作骨溶解定性判断，根据步骤s3、s4、s5作骨溶解定量判断。
实施例6
一种假体无菌性松动骨溶解半定量检测方法，包括：
s1、取关节置换术患者假体安装位置的人工界膜组织处细胞，设置成对照组和实验组，均采用条件培养基进行培养，对照组在培养10d后，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶，染色，观察trap阳性多核细胞的变化并计数；
s2、将步骤s1中在条件培养基中培养后的实验组分为实验i组和实验ⅱ组，将实验i组在含有cocl2溶液及crcl3溶液的混合液培养基中继续培养27h；实验ⅱ组在原条件培养基中培养26h后，将原条件培养基更换为不含金属离子的条件培养基继续培养58h，分别收集实验i组、实验ⅱ组的细胞及上清夜；所述混合液培养基中cocl2溶液的浓度为13mg/l，crcl3溶液的浓度为18mg/l；
s3、分别采用rank试剂盒、opg试剂盒检测步骤s2得到的上清液中的rank蛋白、opg蛋白的分泌量，计算实验i组、实验ⅱ组中的rank/opg的比值；
s4、采集步骤s1中关节置换术患者的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测患者外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s5、采集正常人的外周血单核细胞，采用流式细胞检测仪检测正常人外周血单核细胞中的cd14+cd16+单核细胞比例；
s6、根据步骤s1、s3、s4、s5得到的检测值，综合评判关节置换术患者假体无菌性松动的骨溶解情况。
最后，通过先判断步骤s3中计算的rank/opg的比值是否超过正常值，再判断步骤s4和s5，根据步骤s1作骨溶解定性判断，根据步骤s3、s4、s5作骨溶解定量判断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。