一种同时检测生地大黄中11种成分的HPLC方法与流程

本发明涉及中药材质量控制
技术领域：
，具体涉及一种同时检测生地大黄中11种成分的hplc方法。
背景技术：
生地黄，别名为地黄、生地、地髓、原生地、干地黄、苄、芑、牛奶子、婆婆奶，玄参科、地黄属植物，地黄的块根，多年生直立草本。喜温和气候及阳光充足之地，怕积水，为清热凉血药。用于温热病热入营血，身热口干、舌绛或红等症状，有清热生津滋阴，养血的功效。主要含有苷类、糖类及氨基酸类等成分，其中环烯醚萜苷类成分和苯乙醇苷类成分是地黄中的主要成分，同时也是地黄发挥药效的主要物质基础。大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的根茎。功能主治为泻热毒，破积滞，行瘀血。大黄主要含有蒽醌、鞣质等成分，其中蒽醌苷元是大黄活血化瘀主要物质基础。由于生地大黄是治疗吐血、便血经典处方，传统通常以汤剂的形式使用，也可以采用现代化方式开发成为颗粒剂的方式使用，但是未见生地大黄配伍的药物，包括口服液、颗粒剂等等的质量检测方法，无法有效控制其质量。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种同时检测生地大黄中11种成分的hplc方法，它包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取生地大黄药物，加入低级醇溶解过滤即得供试品溶液；(2)对照品溶液制备：称取梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，混合，加入低级醇配置成混合对照品溶液；(3)分别将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱；流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.1％磷酸水溶液；洗脱程序：见下表：时间/min0.1％的磷酸水溶液/体积分数乙腈/体积分数098.0％2.0％297.0％3.0％396.5％3.5％1395.0％5.0％1884.0％16％3865.0％35％6440.0％60％7540.0％60％检测波长：210nm；(4)根据检测结果计算得到待检颗粒中梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚以及大黄素甲醚的含量。进一步地，所述生地大黄药物是指用生地黄、大黄制备而成的汤剂、颗粒剂、口服液、胶囊等。进一步地，步骤(1)中，所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇。进一步地，所述低级醇为甲醇。进一步地，步骤(1)中，所述过滤的微孔滤膜的直径为0.22μm。进一步地，步骤(2)中，所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇。进一步地，所述低级醇为甲醇。进一步地，步骤(3)中，所述色谱柱为accurasil-c18柱4.6×250mm，5μm。进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件中柱温为30℃。进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件中流速为1ml/min。本发明成功建立了同时检测生地大黄中11种成分的hplc方法，该方法准确可靠，简便快速，为生地大黄药物的质量评价与控制提供依据，同时也为中药复方中含有生地黄以及大黄的药物制剂的质量评价奠定了基础。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为对照品的色谱图，其中，1为梓醇，2为没食子酸，3为桃叶珊瑚苷，4为地黄苷d，5为地黄苷a，6为毛蕊花糖苷，7为芦荟大黄素，8为大黄酸，9为大黄素，10为大黄酚，11为大黄素甲醚。图2为供试品的色谱图，其中，1为梓醇，2为没食子酸，3为桃叶珊瑚苷，4为地黄苷d，5为地黄苷a，6为毛蕊花糖苷，7为芦荟大黄素，8为大黄酸，9为大黄素，10为大黄酚，11为大黄素甲醚。图3为大黄中各成分在254nm的色谱图，其中，1为没食子酸，2为芦荟大黄素，3为大黄酸，4为大黄素，5为大黄酚，6为大黄素甲醚。图4为大黄中各成分在210nm的色谱图，其中，1为没食子酸，2为芦荟大黄素，3为大黄酸，4为大黄素，5为大黄酚，6为大黄素甲醚。图5为生地黄中各成分在254nm的色谱图。图6为生地黄中各成分在210nm的色谱图，其中，1为梓醇，2为桃叶珊瑚苷，3为地黄苷d，4为地黄苷a，5为毛蕊花糖苷。图7为以甲醇-0.1％磷酸水为流动相的生地大黄颗粒的色谱图，其中，1为梓醇，2为没食子酸，3为桃叶珊瑚苷，4为地黄苷d，5为地黄苷a，6为毛蕊花糖苷，7为芦荟大黄素，8为大黄酸，9为大黄素，10为大黄酚，11为大黄素甲醚。图8为以乙腈-0.1％磷酸水为流动相的色谱图，其中，1为梓醇，2为没食子酸，3为桃叶珊瑚苷，4为地黄苷d，5为地黄苷a，6为毛蕊花糖苷，7为芦荟大黄素，8为大黄酸，9为大黄素，10为大黄酚，11为大黄素甲醚。具体实施方式实施例1、本发明的检测方法(1)实验材料生地黄饮片购买于宝鸡汉方国药饮片有限责任公司，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为玄参科(scrophulariaceae)植物生地黄(rehmanniaglutinosa)的块根；大黄饮片购于兰州旭康药业有限公司，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为廖科(polygonaceae)植物(rheumpalmatum)的干燥根及根茎；生地黄汤颗粒实验室自制。梓醇(批号：110808-200508)、没食子酸(批号：110831-200302)，芦荟大黄素(批号：110795-200806)，大黄酸(批号：110757-200716)，大黄素(批号：110756-201010)，大黄酚(批号：110796-200310)，大黄素甲醚(批号：110758-200611)对照品购于中国食品药品检定研究院。桃叶珊瑚苷(批号：1512102)，地黄苷a(批号:16051725)，地黄苷d(批号：150401)，毛蕊花糖苷(批号：150402)对照品，购于成都普菲德生物技术有限公司。水为娃哈哈纯净水，乙腈为fisher色谱纯，其它试剂均为分析纯。(2)实验仪器agilent1260infinity高效液相色谱仪(g1311c型四元泵，g1329b型进样器，g4212b型二极管阵列检测器，openlab工作站)；电子天平(万分之一)(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，sartoriusmc电子天平(十万分之一)。(3)检测方法及结果①生地大黄的制备：称取生地黄600g，大黄20g，加10倍量20％乙醇浸渍提取36h，滤过，滤液减压浓缩、干燥(60℃)，粉碎，80％乙醇制粒，即得生地大黄颗粒剂。②供试品溶液制备：分别称取3批不同时间制备的生地大黄颗粒2.0g，研细，精密称定，置于25ml容量瓶中，加入色谱甲醇20ml，精密称重，超声30min，放至室温，用色谱甲醇补足重量，摇匀并滤过，取续滤液，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。③对照品溶液的制备：精密称取梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，色谱甲醇溶解，分别制成质量浓度为110μg·ml-1梓醇，55μg·ml-1没食子酸，198μg·ml-1桃叶珊瑚苷，132μg·ml-1地黄苷d，220μg·ml-1地黄苷a，176μg·ml-1毛蕊花糖苷，99μg·ml-1芦荟大黄素，99μg·ml-1大黄酸，98μg·ml-1大黄素，98μg·ml-1大黄酚，99μg·ml-1大黄素甲醚的储备液。分别精密移取梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚储备液各0.1ml至量瓶中，制成质量浓度为含10.0μg·ml-1梓醇、5.0μg·ml-1没食子酸、18μg·ml-1桃叶珊瑚苷、12.0μg·ml-1地黄苷d、20.0μg·ml-1地黄苷a、16.0μg·ml-1毛蕊花糖苷、9.0μg·ml-1芦荟大黄素、9.0μg·ml-1大黄酸、8.9μg·ml-1大黄素、8.9μg·ml-1大黄酚、9.0μg·ml-1大黄素甲醚的混合对照品溶液。④分别将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：accurasil-c18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.1％磷酸水溶液；洗脱程序：见表1：表1梯度洗脱程序时间/min0.1％的磷酸水溶液/体积分数乙腈/体积分数098.0％2.0％297.0％3.0％396.5％3.5％1395.0％5.0％1884.0％16％3865.0％35％6440.0％60％7540.0％60％检测波长：210nm；柱温：30℃；流速1ml/min；进样量10μl，理论塔板数以梓醇计不低于3000。对照品的色谱图见图1，供试品的色谱图见图2。⑤分别记录3批生地大黄颗粒的峰面积，按外标两点法计算样品中梓醇、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、没食子酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，结果见表2。注：批号表示生地大黄颗粒的制备时间上述结果表明，本发明的hplc方法可以同时检测生地大黄中11种成分。实施例2、本发明方法的方法学考察(1)线性关系考察用移液器分别精密吸取实施例1制备的混合对照品溶液0.063，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00ml，置于2ml量瓶中，色谱甲醇稀释至刻度，摇匀，得6个系列浓度的混合对照品溶液。在实施例1中的色谱条件下分别进样10μl，以各成分的质量浓度x(μg·ml-1)分别对相应峰面积y进行线性回归，得相应的回归方程和相关系数(见表3)。表3、11种成分的线性回归方程及线性范围上述结果表明在一定质量浓度范围内，各成分均有良好的线性关系。(2)精密度考察分别精密移取实施例1制备的混合对照品溶液适量，按照实施例1中的色谱条件重复进样6次，每次进样10μl，记录峰面积。梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积积分值的rsd分别为1.37％、0.98％、1.16％、1.21％、1.05％、0.99％、1.16％、1.15％、1.02％、1.00％、1.03％，均符合要求，表明该仪器的精密度良好。(3)稳定性考察取实施例1中制备的供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h，24h按实施例1中的色谱条件进样10μl，记录峰面积。梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰峰面积积分值的rsd分别为1.64％、1.24％、1.31％、1.00％、1.05％、0.98％、1.20％、1.09％、0.98％、1.06％、1.12％，均符合要求，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。(4)重复性实验取实施例1中的生地大黄颗粒6份，分别按照实施例1中供试品溶液制备方法制备，依照实施例1中的色谱条件进样10μl，记录峰面积，外标两点法计算各成分含量及rsd。结果生地黄汤中梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为4.3463mg·g-1，1.7420×10-2mg·g-1，0.1021mg·g-1,1.4872mg·g-1，0.5855mg·g-1，0.4231mg·g-1，0.3426×10-2mg·g-1，1.1138×10-2mg·g-1，0.4148×10-2mg·g-1，0.2415×10-2mg·g-1，0.0508×10-2mg·g-1；含量的rsd分别为1.69％，1.34％，2.15％，1.00％，1.21％，1.56％，2.27％，1.74％，1.35％，1.65％，1.16％，表明重复性良好。(5)加样回收试验精密称取已知含量的同一生地大黄颗粒6份，分别加入适量梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚对照品。按照实施例1中的方法制备供试液，依照实施例1中的色谱条件，分别进样10μl，记录峰面积，外标两点法计算含量及加样回收率。结果见表4。表4、加样回收率试验结果上述结果表明，梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率分别为99.26％、97.53％、96.63％、97.95％、98.49％、97.17％、96.67％、97.50％、96.96％、98.25％、96.83％；rsd分别为：0.62％、1.65％、1.02％、1.48％、0.80％、1.75％、1.34％、1.72％、2.13％、0.70％、1.78％，说明该方法准确度良好。实施例3、本发明检测条件筛选(1)波长的选择：在进行含量测定方法学考察时，发现梓醇、桃叶珊瑚苷、地黄苷a、地黄苷d在203nm处有末端吸收，毛蕊花糖苷最大吸收在334nm处，大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在254nm处有强吸收峰(见图3)，在210nm处也有吸收峰(见图4)。经过在不同波长下及转换波长多次实验，结果发现全波长扫描生地黄中梓醇、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷在254nm没有吸收(见图5)，在210nm有吸收(见图6)。而采用转化波长进行测定时基线波动较大。综合考虑各成分在210nm波长下，均能得到较好的响应值，灵敏度较好，杂质峰干扰较小，同时也避免了更换检测波长引起的基线漂移，最终确定210nm作为检测波长。(2)流动相的确定依据待测11种成分的理化性质及色谱行为，实验过程对不同比例的甲醇-0.1％磷酸溶液及乙腈-0.1％磷酸溶液进行了考察(色谱图分别见图7、图8)，结果表明以甲醇-0.1％磷酸溶液进行梯度洗脱，系统压力较高，以乙腈-0.1％磷酸水进行梯度洗脱，检测波长为210nm，柱温30℃，流速1ml·min-1时，样品中各成分分离度良好，峰型尖锐对称，色谱图基线平稳，因此最终确定以乙腈-0.1％磷酸水溶液系统作为流动相，进行梯度洗脱。综上，本发明建立了生地大黄药物中11种指标成分梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷d、地黄苷a、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量测定方法，方法学考察结果表明该方法的精密度、稳定性、重现性、加样回收率均符合要求。而且操作简单、对仪器设备要求不高，重复性好，能够同时进行11种成分的含量测定，简化了样品制备方法，节约分析时间，为生地大黄药物的质量评价与控制提供依据，同时也为中药复方中含有生地黄以及大黄的药物制剂的质量评价奠定了基础。当前第1页12