本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法。
背景技术
水稻原产我国，已有七千年多年的种植历史，我国是世界上最大的水稻生产国和消费国，水稻是国民重要主粮之一。我国稻区辽阔，除青海省外，其余各省均有种植水稻。稻曲病是由绿核菌侵染水稻穗部而引起的一种真菌性病害，侵染后除危害自身谷粒外，还致使病穗空秕率增多，千粒重降低，导致减产欠收，直接影响水稻产量和质量，产生的稻曲毒素对人畜均有毒害作用，其中稻曲毒素a的含量最高且活性最大，其次是稻曲毒素b。目前的检测方法主要为有机试剂提取后，通过液相色谱法、液相色谱质联用法、液相色谱高分辨质谱法等，对稻曲毒素进行检测分析，目前的方法存在前处理时间长、试剂消耗大、重复性差、部分设备昂贵不利于实施的缺点。为此，我们提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法。
技术实现要素：
本发明提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，包括如下步骤：
s1：标准样品溶液制备：选取稻曲毒素a以及稻曲毒素b，分别用超纯水将稻曲毒素a以及稻曲毒素b稀释为质量浓度为0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l的标准溶液；
s2：样品的提取：选取粉碎稻谷样品，并将粉碎稻谷样品置于离心管中，加酸性水溶液高速匀浆提取后，高速离心处理，取上清液，残渣再加酸性水溶液高速匀浆均质提取，再次高速离心，合并上清液于浓缩瓶中，浓缩后，待净化；
s3：样品的净化：将s2中处理后的上清液置于c18固相萃取柱内，依次用甲醇、超纯水活化，上清液用甲醇以及水混合溶液洗脱，浓缩近干，然后再次利用甲醇与甲酸水混合溶液定容，过滤膜，完成后待测；
s4：将s3中净化后的稻谷样品进行超高效液相色谱串联质谱分析，具体步骤如下；
(1)、选取一支色谱柱，并向其中注入a、b混合流动相，且a相具体为水，所述水内含有甲酸，b相具体为色谱级甲醇，a、b混合流动相以梯度洗脱方式，按0.1-0.4ml/min的流速进入色谱柱内，分析时间5分钟，能够保证目标物和杂质充分分离；
(2)、上述完成后，再次对其置于三重四级杆式质谱仪内，以高能电子流轰击样本，使该样本失去电子变为带正电荷的分子离子和碎片离子，通过雾化器、干燥气以及碰撞气对分子离子进行质谱优化处理，且雾化器气流为1.5-3l/min，干燥气气流为15-20l/min，碰撞气为200-230kpa；
s5：添加一定浓度标准溶液至粉碎的空白稻谷样品内，得到添加回收样品，将添加回收样品、待测样品均按照s2、s3以及s4对样本进行处理，以s1中配制的0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l六个浓度为标准工作曲线，然后进行lc-msms分析分别得到相应峰面积，将添加回收样品和待测样品峰面积带入标准工作曲线方程，计算稻曲毒素a以及稻曲毒素b的添加回收率和变异系数，并得到待测样品中的毒素含量，即完成稻谷中稻曲毒素的检测。
优选的，在s2中称取稻谷样品量为10-20g，两次分别加入20-30ml酸性水溶液。
优选的，样品提取的酸性水溶液ph＝3-5，若是不处在该区域，则使用甲酸进行调节。
优选的，在s2中离心处理中，高速匀浆转速为10000-12000rpm，且时间为2min。
优选的，在s3中的甲醇以及水的体积比为5：5-8：2。
优选的，在进行超高效液相色谱串联质谱分析中，a相的水中甲酸的含量为0.1-0.2％。
优选的，所述色谱柱的柱温均为30-40摄氏度。
优选的，所述色谱柱具体为岛津shim-packxr-c8，规格2.0×100mm，粒径1.6μm，进样量10μl。
本发明提出的一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，有益效果在于：该稻谷中稻曲毒素的检测方法通过样品加酸化水后，采用高速均质提取，可同时分析稻曲毒素a与稻曲毒素b，方法耗时短，提取不消耗有机试剂，减少了环境污染，净化选择相对成本低廉的c18固相萃取小柱，节约检测成本，重现性好，提高了工作效率。本发明的目的是提供一种简单、快速、经济、灵敏、安全，可用于分析和监测水稻中的稻曲毒素a与稻曲毒素b的检测方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，包括如下步骤：
s1：标准样品溶液制备：选取稻曲毒素a以及稻曲毒素b，分别用超纯水将稻曲毒素a以及稻曲毒素b稀释为质量浓度为0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l的标准溶液；
s2：样品的提取：选取粉碎稻谷样品，并将粉碎稻谷样品置于离心管中，加酸性水溶液高速匀浆提取后，高速离心处理，取上清液，残渣再加酸性水溶液高速匀浆均质提取，再次高速离心，合并上清液于浓缩瓶中，浓缩后，待净化；
s3：样品的净化：将s2中处理后的上清液置于c18固相萃取柱内，依次用甲醇、超纯水活化，上清液用甲醇以及水混合溶液洗脱，浓缩近干，然后再次利用甲醇与甲酸水混合溶液定容，过滤膜，完成后待测；
s4：将s3中净化后的稻谷样品进行超高效液相色谱串联质谱分析，具体步骤如下；
(1)、选取一支色谱柱，并向其中注入a、b混合流动相，且a相具体为水，所述水内含有甲酸，b相具体为色谱级甲醇，a、b混合流动相以梯度洗脱方式，按0.1-0.4ml/min的流速进入色谱柱内，分析时间5分钟，能够保证目标物和杂质充分分离；
梯度洗脱
(2)、上述完成后，再次对其置于三重四级杆式质谱仪内，以高能电子流轰击样本，使该样本失去电子变为带正电荷的分子离子和碎片离子，通过雾化器、干燥气以及碰撞气对分子离子进行质谱优化处理，且雾化器气流为1.5l/min，干燥气气流为15l/min，碰撞气为200kpa；具体见下表：
质谱优化条件表
a：定量离子；b：定性离子
s5：添加一定浓度标准溶液至粉碎的空白稻谷样品内，得到添加回收样品，将添加回收样品、待测样品均按照s2、s3以及s4对样本进行处理，以s1中配制的0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l六个浓度为标准工作曲线，然后进行lc-msms分析分别得到相应峰面积，将添加回收样品和待测样品峰面积带入标准工作曲线方程，计算稻曲毒素a以及稻曲毒素b的添加回收率和变异系数，并得到待测样品中的毒素含量，即完成稻谷中稻曲毒素的检测。
在s2中称取稻谷样品量为10-20g，两次分别加入20-30ml酸性水溶液。
样品提取的酸性水溶液ph＝3-5，若是不处在该区域，则使用甲酸进行调节。
在s2中离心处理中，高速匀浆转速为10000rpm，且时间为2min。
在s3中的甲醇以及水的体积比为5：5-8：2。
在进行超高效液相色谱串联质谱分析中，a相的水中甲酸的含量为0.1-0.2％。
所述色谱柱的柱温均为30摄氏度。
所述色谱柱具体为岛津shim-packxr-c8，规格2.0×100mm，粒径1.6μm，进样量10μl。
实施例2
本发明提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，包括如下步骤：
s1：标准样品溶液制备：选取稻曲毒素a以及稻曲毒素b，分别用超纯水将稻曲毒素a以及稻曲毒素b稀释为质量浓度为0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l的标准溶液；
s2：样品的提取：选取粉碎稻谷样品，并将粉碎稻谷样品置于离心管中，加酸性水溶液高速匀浆提取后，高速离心处理，取上清液，残渣再加酸性水溶液高速匀浆均质提取，再次高速离心，合并上清液于浓缩瓶中，浓缩后，待净化；
s3：样品的净化：将s2中处理后的上清液置于c18固相萃取柱内，依次用甲醇、超纯水活化，上清液用甲醇以及水混合溶液洗脱，浓缩近干，然后再次利用甲醇与甲酸水混合溶液定容，过滤膜，完成后待测；
s4：将s3中净化后的稻谷样品进行超高效液相色谱串联质谱分析，具体步骤如下；
(1)、选取一支色谱柱，并向其中注入a、b混合流动相，且a相具体为水，所述水内含有甲酸，b相具体为色谱级甲醇，a、b混合流动相以梯度洗脱方式，按0.1-0.4ml/min的流速进入色谱柱内，分析时间5分钟，能够保证目标物和杂质充分分离；
梯度洗脱
(2)、上述完成后，再次对其置于三重四级杆式质谱仪内，以高能电子流轰击样本，使该样本失去电子变为带正电荷的分子离子和碎片离子，通过雾化器、干燥气以及碰撞气对分子离子进行质谱优化处理，且雾化器气流为2l/min，干燥气气流为16l/min，碰撞气为210kpa；
质谱优化条件表
a：定量离子；b：定性离子
s5：添加一定浓度标准溶液至粉碎的空白稻谷样品内，得到添加回收样品，将添加回收样品、待测样品均按照s2、s3以及s4对样本进行处理，以s1中配制的0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l六个浓度为标准工作曲线，然后进行lc-msms分析分别得到相应峰面积，将添加回收样品和待测样品峰面积带入标准工作曲线方程，计算稻曲毒素a以及稻曲毒素b的添加回收率和变异系数，并得到待测样品中的毒素含量，即完成稻谷中稻曲毒素的检测。
在s2中称取稻谷样品量为10-20g，两次分别加入20-30ml酸性水溶液。
样品提取的酸性水溶液ph＝3-5，若是不处在该区域，则使用甲酸进行调节。
在s2中离心处理中，高速匀浆转速为10500rpm，且时间为2min。
在s3中的甲醇以及水的体积比为5：5-8：2。
在进行超高效液相色谱串联质谱分析中，a相的水中甲酸的含量为0.1-0.2％。
所述色谱柱的柱温均为33摄氏度。
所述色谱柱具体为岛津shim-packxr-c8，规格2.0×100mm，粒径1.6μm，进样量10μl。
实施例3
本发明提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，包括如下步骤：
s1：标准样品溶液制备：选取稻曲毒素a以及稻曲毒素b，分别用超纯水将稻曲毒素a以及稻曲毒素b稀释为质量浓度为0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l的标准溶液；
s2：样品的提取：选取粉碎稻谷样品，并将粉碎稻谷样品置于离心管中，加酸性水溶液高速匀浆提取后，高速离心处理，取上清液，残渣再加酸性水溶液高速匀浆均质提取，再次高速离心，合并上清液于浓缩瓶中，浓缩后，待净化；
s3：样品的净化：将s2中处理后的上清液置于c18固相萃取柱内，依次用甲醇、超纯水活化，上清液用甲醇以及水混合溶液洗脱，浓缩近干，然后再次利用甲醇与甲酸水混合溶液定容，过滤膜，完成后待测；
s4：将s3中净化后的稻谷样品进行超高效液相色谱串联质谱分析，具体步骤如下；
(1)、选取一支色谱柱，并向其中注入a、b混合流动相，且a相具体为水，所述水内含有甲酸，b相具体为色谱级甲醇，a、b混合流动相以梯度洗脱方式，按0.1-0.4ml/min的流速进入色谱柱内，分析时间5分钟，能够保证目标物和杂质充分分离；
梯度洗脱
(2)、上述完成后，再次对其置于三重四级杆式质谱仪内，以高能电子流轰击样本，使该样本失去电子变为带正电荷的分子离子和碎片离子，通过雾化器、干燥气以及碰撞气对分子离子进行质谱优化处理，且雾化器气流为2.5l/min，干燥气气流为18l/min，碰撞气为220kpa；具体见下表：
质谱优化条件表
a：定量离子；b：定性离子
s5：添加一定浓度标准溶液至粉碎的空白稻谷样品内，得到添加回收样品，将添加回收样品、待测样品均按照s2、s3以及s4对样本进行处理，以s1中配制的0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l六个浓度为标准工作曲线，然后进行lc-msms分析分别得到相应峰面积，将添加回收样品和待测样品峰面积带入标准工作曲线方程，计算稻曲毒素a以及稻曲毒素b的添加回收率和变异系数，并得到待测样品中的毒素含量，即完成稻谷中稻曲毒素的检测。
在s2中称取稻谷样品量为10-20g，两次分别加入20-30ml酸性水溶液。
样品提取的酸性水溶液ph＝3-5，若是不处在该区域，则使用甲酸进行调节。
在s2中离心处理中，高速匀浆转速为11000rpm，且时间为2min。
在s3中的甲醇以及水的体积比为5：5-8：2。
在进行超高效液相色谱串联质谱分析中，a相的水中甲酸的含量为0.1-0.2％。
所述色谱柱的柱温均为37摄氏度。
所述色谱柱具体为岛津shim-packxr-c8，规格2.0×100mm，粒径1.6μm，进样量10μl。
实施例4
本发明提出了一种快速检测稻谷中两种稻曲毒素的方法，包括如下步骤：
s1：标准样品溶液制备：选取稻曲毒素a以及稻曲毒素b，分别用超纯水将稻曲毒素a以及稻曲毒素b稀释为质量浓度为0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l的标准溶液；
s2：样品的提取：选取粉碎稻谷样品，并将粉碎稻谷样品置于离心管中，加酸性水溶液高速匀浆提取后，高速离心处理，取上清液，残渣再加酸性水溶液高速匀浆均质提取，再次高速离心，合并上清液于浓缩瓶中，浓缩后，待净化；
s3：样品的净化：将s2中处理后的上清液置于c18固相萃取柱内，依次用甲醇、超纯水活化，上清液用甲醇以及水混合溶液洗脱，浓缩近干，然后再次利用甲醇与甲酸水混合溶液定容，过滤膜，完成后待测；
s4：将s3中净化后的稻谷样品进行超高效液相色谱串联质谱分析，具体步骤如下；
(1)、选取一支色谱柱，并向其中注入a、b混合流动相，且a相具体为水，所述水内含有甲酸，b相具体为色谱级甲醇，a、b混合流动相以梯度洗脱方式，按0.1-0.4ml/min的流速进入色谱柱内，分析时间5分钟，能够保证目标物和杂质充分分离；
梯度洗脱
(2)、上述完成后，再次对其置于三重四级杆式质谱仪内，以高能电子流轰击样本，使该样本失去电子变为带正电荷的分子离子和碎片离子，通过雾化器、干燥气以及碰撞气对分子离子进行质谱优化处理，且雾化器气流为3l/min，干燥气气流为20l/min，碰撞气为230kpa；具体见下表：
质谱优化条件表
a：定量离子；b：定性离子
s5：添加一定浓度标准溶液至粉碎的空白稻谷样品内，得到添加回收样品，将添加回收样品、待测样品均按照s2、s3以及s4对样本进行处理，以s1中配制的0.005mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l六个浓度为标准工作曲线，然后进行lc-msms分析分别得到相应峰面积，将添加回收样品和待测样品峰面积带入标准工作曲线方程，计算稻曲毒素a以及稻曲毒素b的添加回收率和变异系数，并得到待测样品中的毒素含量，即完成稻谷中稻曲毒素的检测。
在s2中称取稻谷样品量为10-20g，两次分别加入20-30ml酸性水溶液。
样品提取的酸性水溶液ph＝3-5，若是不处在该区域，则使用甲酸进行调节。
在s2中离心处理中，高速匀浆转速为12000rpm，且时间为2min。
在s3中的甲醇以及水的体积比为5：5-8：2。
在进行超高效液相色谱串联质谱分析中，a相的水中甲酸的含量为0.1-0.2％。
所述色谱柱的柱温均为40摄氏度。
所述色谱柱具体为岛津shim-packxr-c8，规格2.0×100mm，粒径1.6μm，进样量10μl。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。