本发明属于生物技术领域，具体涉及一种b型金葡菌肠毒素的alphalisa检测试剂盒。
背景技术
seb(b型金葡菌肠毒素)是金葡菌分泌到上清中的重要毒素，它是重要的生物战剂，同时也是金葡菌污染导致食物中毒的重要因素。seb本身没有细胞毒性，其毒性来源于其超抗原特性。所谓超抗原(superantigen，sag)是一类不需要抗原提呈细胞(antigen-presentingcell，apc)处理而能够直接与mhcⅱ类分子结合，导致带有特异vβ节段t细胞大量增殖的抗原分子。其激活能力是普通抗原的2000-50000倍，因此只需极低浓度(1～10pg/ml)即可刺激t细胞活化增殖，释放大量细胞因子。
seb对人中毒剂量低，在气溶胶吸入的情况下，ed50(50％effectivedose，半数有效量)为1ng/kg，ld50(50％lethaldose，半数致死量)为0.02μg/kg。
对于seb引起的中毒，需要直接对毒素进行鉴定；如为食品污染，则首先应对可疑食品进行细菌培养，如发现葡萄球菌生长，再进行产毒试验。如果能在可疑食品中既培养出细菌，又检测出毒素，即能明确诊断。
但是在对金葡菌培养上清中的毒素进行免疫学鉴定时，金葡菌的培养上清中同时存在蛋白a，该蛋白能够与多种哺乳动物igg抗体的fc段结合，导致免疫学结果出现假阳性。目前解决该问题的方法是对抗体进行改造，去除其fc段，但是制备fab段相对复杂；或者用羊抗体，但是制备羊抗体相对鼠单抗较为麻烦。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是如何降低蛋白a对b型金葡菌肠毒素检测的影响。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种b型金葡菌肠毒素的alphalisa检测试剂盒。
本发明提供的alphalisa检测试剂盒包括seb捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的seb检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。
上述试剂盒中，所述seb捕获抗体标记的受体微球为seb捕获抗体标记的受体微球溶液。所述seb捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为10-20μg/ml；优选为13.3μg/ml。
所述生物素标记的seb检测抗体为生物素标记的seb检测抗体溶液。所述生物素标记的seb检测抗体溶液的工作浓度为0.2-0.8μg/ml；优选为0.4μg/ml。
上述试剂盒还包括alphalisa反应缓冲液。所述alphalisa反应缓冲液具体为10×alphalisa反应缓冲液，其配方如下：250mmhepes(ph7.4)，1％casein，10mg/mldextran-500，5％tritonx-100和0.5％proclin-300。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述试剂盒在检测b型金葡菌肠毒素中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在制备检测b型金葡菌肠毒素的产品中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在检测待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在制备检测待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素的产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素的方法。
本发明提供的检测待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素的方法包括采用alphalisa技术检测待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素的步骤。
上述方法中，采用alphalisa技术检测待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素的方法包括如下步骤：
(1)将seb捕获抗体标记受体微球，得到seb捕获抗体标记的受体微球；
(2)将生物素标记seb检测抗体，得到生物素标记的seb检测抗体；
(3)将所述seb捕获抗体标记的受体微球和所述生物素标记的seb检测抗体加入各检测孔中，然后向所述检测孔中加入待测样品，孵育；
(4)向(3)得到的检测孔中加入链霉亲和素标记的供体微球，孵育；
(5)读取所述检测孔的检测信号值，根据所述检测信号值判断待测样品中是否含有b型金葡菌肠毒素。
上述方法中，所述(1)还包括如下步骤：用alphalisa反应缓冲液将所述seb捕获抗体标记的受体微球按照1:150的比例进行稀释，得到受体微球溶液；
所述(2)还包括如下步骤：用alphalisa反应缓冲液将所述生物素标记的seb检测抗体按照1:1000的比例进行稀释，得到生物素化抗体溶液。
上述方法中，所述(3)还包括如下步骤：将所述受体微球溶液和所述生物素化抗体溶液混匀，得到混合液；将所述混合液加入所述检测孔中。
在本发明中，所述seb捕获抗体标记的受体微球在混合液中的浓度为33.33μg/ml，所述生物素标记的seb检测抗体在混合液中的浓度为1μg/ml。
上述方法中，所述(3)中，所述孵育的条件为37℃孵育15分钟；所述(4)中，所述孵育的条件为37℃孵育10分钟。
上述方法中，所述(5)中，采用spectramaxi3的alphalisa模块读取所述检测孔的检测信号值，若待测样品的检测信号值大于本底值+3sd，则所述待测样品含有或候选含有b型金葡菌肠毒素，否则待测样品中不含有或候选不含有b型金葡菌肠毒素。
上述方法中，所述本底值具体为本底平均值，所述本底平均值为步骤(3)中不加待测样品，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。
上述试剂盒或方法中，所述seb检测抗体和seb捕获抗体均可按照现有技术中的常规方法制备得到，也可以购买获得。具体制备方法可参照文献“雷祚荣，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，中国科学技术出版社”中的“肠毒素单克隆抗体制备”记载的方法。
本发明提供了一种b型金葡菌肠毒素的alphalisa检测试剂盒。该试剂盒包括seb捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的seb检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。本发明还提供了一种b型金葡菌肠毒素的检测方法，本发明提供的b型金葡菌肠毒素的检测方法是采用alphalisa技术检测b型金葡菌肠毒素。通过实验证明：本发明的b型金葡菌肠毒素的检测方法可以大大降低蛋白a的影响，且本发明的检测方法快速、准确、可靠，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为蛋白a对alphalisa和elisa检测seb的影响。a为alphalisa和elisa检测梯度稀释的蛋白a。蛋白a从100μg/ml到0.01μg/ml进行10倍梯度稀释，x轴是蛋白a浓度的对数。y轴是alphalisa和elisa检测的信号值。b为蛋白a对alphalisa和elisa检测seb的影响。x轴是seb的浓度，y轴是信号比值，其具体计算公式为vseb+pa/vseb。vseb+pa为seb和蛋白a混合物的检测信号值，vseb为seb溶液的检测信号值。
图2为alphalisa和elisa检测菌株上清中的seb。a为r-biopharmridascreen检测上清中的seb。b为rt-qpcr检测seb基因的表达。1-10为9个分离株和1个阴性对照。9个分离株分别是1169、3-4、at、sc2、2-1、3-3、sc1、a8和sc3。c为elisa和alphalisa检测金葡菌上清中的seb。结果以vtest/vcutoff表示。vtest为上清的检测值，vcutoff为cutoff值，cutoff值为本底平均值+3sd。
图3为alphalisa检测seb的灵敏度。a为4参数标准曲线。b为标准曲线的线性范围。
图4为alphalisa检测seb的特异性。sea、seb、sec、sed和see分别为a-e型金葡菌肠毒素；ricin、abrin和btx分别为蓖麻毒素、相思子毒素和肉毒毒素。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的seb检测抗体和seb捕获抗体均为迈迪安生命科学公司的产品，seb捕获抗体的产品目录号为c86220m(克隆号为s222)，seb检测抗体的产品目录号为c86400m(克隆号为s643)。
下述实施例中的seb是按照文献“雷祚荣，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，中国科学技术出版社”中“肠毒素的提纯和鉴定”记载的方法制备得到的，公众可从中国人民解放军军事医学研究院微生物流行病研究所获得。
下述实施例中的10×alphalisa反应缓冲液配方：250mmhepes(ph7.4)，1％casein，10mg/mldextran-500，5％tritonx-100和0.5％proclin-300。
下述实施例中的pbs溶液：浓度0.01mol/l，ph值7.2。
实施例1、蛋白a对elisa和alphalisa检测seb的影响
一、以蛋白a作为待测样品
1、elisa检测
(1)将100μl浓度为1μg/ml的seb捕获抗体加入96孔板，4℃包被过夜。
(2)弃包被液，用200μl含10％fbs的pbst(pbs+10％tween)进行封闭。
(3)弃封闭液，分别加入浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的蛋白a溶液(蛋白a购自sigma公司，货号为p6031；蛋白a溶液的溶剂为pbst)100μl，37℃孵育30分钟，弃上清液，用pbst洗3遍。
(4)加入1:2000生物素标记的seb检测抗体，37℃孵育30分钟，弃上清液，用pbst洗3遍。
(5)加入1：8000稀释的hrp标记的链霉亲和素(购自pierce公司，货号为21126)，37℃孵育30分钟。加入底物(tmb)显色，显色后加入终止液(2mh2so4)终止反应。用spectramaxi3分别读取各孔的od450值，以大于本底平均值+3sd判定为阳性。本底平均值为步骤(3)中加入不含蛋白a的pbst溶液100μl，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。
2、alphalisa检测
(1)按照抗体标记受体微球的标准流程，将seb捕获抗体标记于alphalisa受体微球(购自perkinelmer公司，货号为6772001)上，得到seb捕获抗体标记的受体微球。然后将seb捕获抗体标记的受体微球与含有0.05％proclin-300的pbs溶液混匀，得到受体微球溶液，并使其浓度为5mg/ml。
采用thermo生物素标记试剂盒(购自thermo公司，货号为21435)将生物素标记于seb检测抗体，得到生物素标记的seb检测抗体。然后将生物素标记的seb检测抗体与pbs溶液混匀，得到生物素化抗体溶液，并使其浓度为1mg/ml。
(2)用alphalisa反应缓冲液分别对受体微球溶液和生物素化抗体溶液进行稀释(用alphalisa反应缓冲液按照1:150的比例稀释受体微球溶液；用alphalisa反应缓冲液按照1:1000的比例稀释生物素化抗体溶液)，并将稀释后的溶液混匀，配制受体微球和生物素化抗体混合溶液20μl，其中，受体微球在混合溶液中的浓度为33.33μg/ml，生物素化抗体在混合溶液中的浓度为1μg/ml。
(3)将20μl的受体微球和生物素化抗体混合溶液加入1/2areaplatetm-96(pe)孔中，然后每孔分别加入浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的蛋白a溶液5μl，37℃孵育15分钟，再加入25μl链霉亲和素标记的供体微球(pe)(购自perkinelmer公司，货号为6760002)，浓度为80μg/ml，37℃孵育10分钟，用spectramaxi3(moleculardevice，城市)的alphalisa模块分别读取各孔的检测信号值。以大于本底平均值+3sd判定为阳性。本底平均值为步骤(3)中加入不含蛋白a的溶液，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。
以蛋白a浓度的对数为x轴，分别以elisa检测的od450值和alphalisa检测信号值为y轴绘制曲线。结果如图1a所示。结果显示，用相同的抗体进行检测，随着蛋白a浓度的增加，elisa检测信号值显著升高，elisa的cutoff值为0.26+0.06；而alphalisa的检测信号值没有增高，与本底值接近。可见蛋白a对elisa的结果影响较大，对alphalisa没有显著影响。
二、以蛋白a和seb的混合物作为待测样品
1、待测样品的制备
将不同浓度的蛋白a溶液(溶剂为pbst)分别与不同浓度的seb溶液(溶剂为pbs溶液)混匀，分别得到如下含有seb和蛋白a的混合样品溶液：混合样品溶液1(seb的终浓度为0.05ng/ml，蛋白a的终浓度为1μg/ml)、混合样品溶液2(seb的终浓度为0.1ng/ml，蛋白a的终浓度为1μg/ml)、混合样品溶液3(seb的终浓度为1ng/ml，蛋白a的终浓度为1μg/ml)、混合样品溶液4(seb的终浓度为10ng/ml，蛋白a的终浓度为1μg/ml)、混合样品溶液5(seb的终浓度为100ng/ml，蛋白a的终浓度为1μg/ml)、混合样品溶液6(seb的终浓度为0.05ng/ml，蛋白a的终浓度为100μg/ml)、混合样品溶液7(seb的终浓度为0.1ng/ml，蛋白a的终浓度为100μg/ml)、混合样品溶液8(seb的终浓度为1ng/ml，蛋白a的终浓度为100μg/ml)、混合样品溶液9(seb的终浓度为10ng/ml，蛋白a的终浓度为100μg/ml)、混合样品溶液10(seb的终浓度为100ng/ml，蛋白a的终浓度为100μg/ml)。
2、alphalisa和elisa检测seb
分别采用alphalisa和elisa检测步骤1中制备的混合样品溶液1-10及不含蛋白a的浓度分别为0.05ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的seb溶液。检测方法同步骤一中的alphalisa和elisa方法。
以seb浓度为x轴，信号比值为y轴绘制曲线。信号比值的计算公式如下：vseb+pa/vseb。其中，vseb+pa为含有蛋白a和seb的混合样品溶液检测的信号值；vseb为不含有蛋白a的seb溶液检测的信号值。
结果如图1b所示。结果显示，对于alphalisa，1μg/ml和100μg/ml的蛋白a都不会提高信号值，而对于elisa，在seb浓度低于10ng/ml时，1μg/ml的蛋白a将信号提高了1.31到3.02倍，100μg/ml的蛋白a将信号提高了2.39到5.95倍。可见蛋白a明显的影响了elisa检测的信号值。
实施例2、elisa和alphalisa对金葡菌培养上清中seb的检测
一、qpcr和r-biopharmridascreen检测产seb菌株
选取10株金黄色葡萄球菌(s-6、1169、3-4、at、sc2、2-1、3-3、sc1、a8和sc3)，分别采用rt-qpcr和r-biopharmridascreen检测10株金黄色葡萄球菌中的产seb菌株和不产seb菌株。
1、r-biopharmridascreen检测产seb菌株
肉汤培养基分别培养10株金黄色葡萄球菌至24小时，12000rpm离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，seb酶联法检测上清液中的seb。seb酶联法按照r-biopharmridascreen(r-biopharmag，darmstadt，germany)说明书进行操作。
r-biopharmridascreen检测结果如图2a所示。结果表明：10株金黄色葡萄球菌中，s-6为产seb菌株，而其它菌株均为不产seb菌株。
2、rt-qpcr检测
采用rt-qpcr对金黄色葡萄球菌菌株的seb表达进行转录水平鉴定。具体步骤如下：
(1)cdna的获得
肉汤培养基分别培养10株金黄色葡萄球菌至12小时，取500μl菌液采用rna提取试剂盒rneasyminikit(qiagen，valencia，ca)提取总rna，然后采用反转录试剂盒superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr进行反转录，得到cdna，以上提取和反转录操作均按照试剂盒说明操作。
(2)rt-qpcr
以步骤(1)获得的cdna为模板，采用qpcr试剂盒(powerupsybrgreenmastermix)进行qpcr，检测seb基因的表达情况。seb基因表达的检测引物序列如下：
entb-f：5’-agaaaaaggtgactgctcaagaat-3’；
entb-r：5’-cgtttcataaggcgagttgtt-3’。
qpcr仪器为viiatm7real-timepcrsystem(invitrogenlifetechnologies，thermoscientific，rockford，usa)；qpcr条件为50℃2min，95℃2min；95℃5sec，60℃30sec，40个循环。
qpcr检测结果如图2b所示。结果表明：10株金黄色葡萄球菌中，s-6为产seb菌株，而其它菌株均为不产seb菌株。
二、elisa和alphalisa检测金葡菌培养上清中的seb
1、elisa检测金葡菌培养上清中的seb
肉汤培养基分别培养10株金黄色葡萄球菌至24小时，12000rpm离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，取过滤后的100μl产seb的上清液和不产seb的上清液作为待测样品，按照实施例1步骤一的1中的方法检测seb。
2、alphalisa检测金葡菌培养上清中的seb
肉汤分别培养10株金黄色葡萄球菌至24小时，12000rpm离心10min，取5μl上清液作为待测样品，按照实施例1步骤一的2中的方法检测seb。
结果如图2c所示。结果显示，alphalisa能够明确的鉴定出10株金黄色葡萄球菌中s-6为seb阳性菌株，明确区分出seb阳性菌株和seb阴性菌株；但elisa则将10株金黄色葡萄球菌均鉴定为seb阳性菌株，即elisa产生假阳性。说明本发明基于alphalisa建立的seb检测方法结果更加准确、可靠。
实施例3、b型金葡菌肠毒素的alphalisa检测试剂盒的灵敏度和特异性检测
一、灵敏度检测
以不同浓度的seb溶液为待测样品，按照实施例1步骤一的2中的alphalisa检测方法检测seb。4参数曲线的seb溶液浓度分别为0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.10ng/ml、0.19ng/ml、0.39ng/ml、0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.13ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml和300ng/ml；线性曲线seb溶液浓度为0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.10ng/ml、0.19ng/ml、0.39ng/ml、0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.13ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml和25ng/ml。
结果如图3所示。结果表明：所建alphalisa检测体系对seb的检测灵敏度高，检测限可以达到25pg/ml，线性范围为25pg/ml到25ng/ml。
二、特异性检测
分别以浓度为50ng/ml和100ng/ml的a型金葡菌肠毒素(sea)、b型金葡菌肠毒素(seb)、c型金葡菌肠毒素(sec)、d型金葡菌肠毒素(sed)、e型金葡菌肠毒素(see)及浓度为100ng/ml的蓖麻毒素(ricin)、相思子毒素(abrin)和肉毒毒素(btx)作为待测样品，按照实施例1步骤一的2中的alphalisa检测方法检测seb。
结果如图4所示。结果表明：所建alphalisa检测体系对seb的检测特异性好，不仅与蓖麻毒素、相思子毒素和肉毒毒素不交叉，与其它4种典型肠毒素也不交叉。