本发明涉及分析化学领域,具体涉及高灵敏h2s电致化学发光传感器的制备方法及其应用,可用于样品中h2s的高灵敏检测。
背景技术
h2s是具有臭鸡蛋气味的气体,在工业生产、动物体内扮演着重要的角色。例如:在工业生产中,如果长时间接触h2s会对人体健康造成危害,导致呼吸困难,损伤神经系统等;在食品生产过程中,需要加入及其微量的h2s作为食品的防腐剂;在哺乳动物体内,h2s被认为是继co、no后的第三种气体信号分子,参与体内各项生理过程,并与许多神经退行性疾病密切关系。因此,开展针对h2s的高灵敏检测方法,对工业生产、疾病诊断和治疗均具有重要意义。
生物传感技术作为分析化学、材料科学和信息科学等多学科交叉和发展的产物,为样品分析检测提供了强有力的工具。生物传感器是一类以生物材料(如抗原-抗体、核酸、酶等)作为识别元件的传感器,通过与目标物发生一系列生物化学反应产生可测量和读取的信号,实现对待测目标物的定性和定量分析检测。以核酸作为生物传感器的识别元件为例,该类型的生物传感器对目标物识别具有高特异性、高亲和力,并结合核酸信号放大技术,在各种痕量且复杂的实际样品分析中起到了举足轻重的作用。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供灵敏度高,制备简单且实施可靠的高灵敏h2s电致化学发光传感器的制备方法及其应用。
为了实现上述的技术目的,本发明采用的技术方案为:
高灵敏h2s电致化学发光传感器的制备方法,其包括如下步骤:
(1)将富含c碱基的引物序列与银离子溶液混合,使引物序列形成c-ag-c发卡结构;
(2)将经步骤(1)处理制得的c-ag-c发卡结构引物序列通过au-s键自组装到金电极表面;
(3)采用巯基己醇溶液对步骤(2)自组装后的金电极表面空白位点进行封闭处理,制得高灵敏h2s电致化学发光传感器。
进一步,步骤(1)的引物序列与银离子溶液按1∶8的体积比混合,并在95℃温度下退火处理。
进一步,步骤(2)中,将10μl经步骤(1)处理制得的c-ag-c发卡结构引物序列滴加到金电极表面,通过au-s键与金电极进行自组装。
优选的,步骤(2)中的金电极直径为2mm。
优选的,所述的金电极经过在麂皮上依次使用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的al2o3粉末进行抛光打磨,并依次使用乙醇、食人鱼洗液和蒸馏水超声清洗。
优选的,步骤(3)中,采用浓度为1mm的巯基己醇溶液对步骤(2)自组装后的金电极表面空白位点进行封闭处理。
优选的,步骤(2)和步骤(3)处理结束后,均需使用ph为7.4的mops缓冲液对金电极进行冲洗。
应用上述制备方法制得的高灵敏h2s电致化学发光传感器对h2s定量检测的方法,其包括如下步骤:
(1)将高灵敏h2s电致化学发光传感器置于一容器中,然后加入含h2s的待检测样品,然后通过顶空富集的方法,使h2s从待检测样品中挥发出并富集于金电极上;
(2)将富集有h2s的金电极浸泡于h1和h2的引物探针中,使其引发hcr扩增反应,令金电极表面产生大量双链dna结构;
(3)将经过步骤(2)处理的金电极浸泡在ru(phen)32+溶液中,使ru(phen)32+能够嵌入双链结构中以产生电致化学发光信号;
(4)使用电化学方法进行电化学响应信号的检测,根据电化学响应信号的强度对标准溶液或经步骤(3)处理后的溶液进行定量测定,实现对待检测的h2s定量检测。
进一步,所述的电化学方法为循环伏安法。
进一步,所述循环伏安法的工作参数为:以0.1v/s的扫描速率,ag/agcl为参比电极,铂丝为对电极,在0.2~1.0v的电位范围内,根据电致化学发光信号的强度对h2s浓度进行定量分析检测。
采用上述的技术方案,本发明具有的有益效果为:本发明基于金属离子和核酸中特定的碱基形成稳定的共价结构的原理,并结合生物传感技术,发明了高灵敏的h2s电致化学发光传感器和其制备方法,其可以通过借助h2s易挥发的性质,采用顶空富集的方式对硫化氢进行富集检测,使得该方法具有良好的选择性,而且该方法还可以实现对纳摩尔浓度的h2s样品进行定量分析检测;另外,本发明方案还可以延伸到生物样品检测、食品安全分析、工业环境监测,使得其具有广阔应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的阐述:
图1为本发明高灵敏h2s电致化学发光传感器的制备方法简要原理图;
图2为本发明高灵敏h2s电致化学发光传感器的标准检测曲线示意图;
其中,图2(a)由下至上a~h依序表示浓度为:0.1,0.3,1,3,10,40,200,1500nm。
具体实施方式
高灵敏h2s电致化学发光传感器的制备方法,其包括如下步骤:
(1)将富含c碱基的引物序列与银离子溶液混合,使引物序列形成c-ag-c发卡结构;
(2)将经步骤(1)处理制得的c-ag-c发卡结构引物序列通过au-s键自组装到金电极表面;
(3)采用巯基己醇溶液对步骤(2)自组装后的金电极表面空白位点进行封闭处理,制得高灵敏h2s电致化学发光传感器。
进一步,步骤(1)的引物序列与银离子溶液按1∶8的体积比混合,并在95℃温度下退火处理。
进一步,步骤(2)中,将10μl经步骤(1)处理制得的c-ag-c发卡结构引物序列滴加到金电极表面,通过au-s键与金电极进行自组装。
优选的,步骤(2)中的金电极直径为2mm。
优选的,所述的金电极经过在麂皮上依次使用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的al2o3粉末进行抛光打磨,并依次使用乙醇、食人鱼洗液和蒸馏水超声清洗。
优选的,步骤(3)中,采用浓度为1mm的巯基己醇溶液对步骤(2)自组装后的金电极表面空白位点进行封闭处理。
优选的,步骤(2)和步骤(3)处理结束后,均需使用ph为7.4的mops缓冲液对金电极进行冲洗。
本发明是通过将一段含有富c的引物序列探针固定在金电极上,在ag+作用下,形成c-ag-c的发卡结构。
当存在目标物h2s时,能与发卡结构中的ag+结合,形成ag2s并导致发卡结构打开,触发两种发卡结构(h1和h2)的引物探针发生hcr反应,在电极表面得到大量含有双链结构的dna产物,ru(phen)32+能够嵌入双链结构中产生ecl信号,进而实现对样品中的h2s高灵敏定量检测。
实施例1
高灵敏h2s电致化学发光传感器的制备方法,其包括如下步骤:
(1)取一金电极(直径2mm)在麂皮上依次使用粒径为1.0、0.3、0.05μm的al2o3粉末进行抛光打磨,并依次使用乙醇、食人鱼洗液和蒸馏水超声清洗;接着,将上述处理后的金电极浸泡在浓度为0.5m的h2so4溶液中,以铂丝作为参比电极和对电极,采用循环伏安法在-0.2~1.0v电位范围内进行扫描,直至得到稳定的循环伏安图,且该循环伏安图具有三个明显的氧化峰位以及一个还原峰位。将金电极取出,使用蒸馏水冲洗干净备用;
(2)将富含c碱基的引物序列与银离子溶液按体积比为1∶8的比例混合,并在95℃温度下退火处理,使引物序列形成c-ag-c发卡结构;富含c碱基的引物序列如下:
primer:5’-sh-tttttccatccctccacctgagtgcctccacccatcc-3’
(3)将10μl经步骤(2)处理制得的c-ag-c发卡结构引物序列通过au-s键自组装到经步骤(1)处理所的金电极表面,然后反应处理2h;
(4)采用1mm的巯基己醇(mch)溶液对步骤(3)自组装后的金电极表面空白位点进行封闭处理,制得高灵敏h2s电致化学发光传感器。
其中,步骤(1)、(3)和步骤(4)处理结束后,均需使用ph为7.4的mops缓冲液对金电极进行冲洗。
测试
在制备好的高灵敏h2s电致化学发光传感器的金电极上滴10μl的mops缓冲液并将其作为工作电极,将工作电极置于500μl离心管中,且离心管中含有50μl样品溶液的,通过顶空富集方法,h2s气体可以从样品中挥发,并在工作电极上富集。
由于primer(即引物序列)是富c的引物序列,与ag+通过c-ag-c结合并发卡结构,当环境中存在h2s时,能结合发卡结构中的ag+形成ag2s,导致发卡结构解离,primer形成单链dna结构。由于primer中含有hcr反应的启动序列,将电极浸泡在含有h1和h2的mops缓冲液中可以触发hcr反应。最后,电极使用mops缓冲液冲洗。
h1和h2的引物序列如下:
h1:5’-ctccacccatcctgctagtgggatgggtggaggcaatca-3’
h2:5’-cactagcaggatgggtggagtgattgcctccacccatcc-3’
将上述制备的金电极浸泡在1mm的ru(phen)32+溶液中4℃放置5h以确保ru(phen)32+嵌入电极表面的双链dna中;随后,将电极使用mops缓冲液彻底清洗确保完全去除非特异性吸附的ru(phen)32+。
ecl检测电解液中含有mops缓冲液和0.02m的tpa。采用循环伏安法,以0.1v/s的扫描速率,以ag/agcl为参比电极,以铂丝为对电极,在0.2~1.0v的电位范围内根据ecl的强度对h2s浓度进行定量分析检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依照本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆属于本发明的涵盖范围。