一种提高拟南芥种子成像质量的方法与流程

本发明属于生物学领域，具体涉及一种提高植物种子成像质量方法的领域。

背景技术：

拟南芥是植物研究中的模式植物，属于十字花科，被子植物门，双子叶植物纲。拟南芥的种子极小，千粒重约0.02g，每株结籽数量随各植株生育期长短及植物营养条件而异，少者约结粒数百，多者可达万粒。目前对于拟南芥种子的研究主要集中在生长素、脱落酸、赤霉素等植物生长激素以及转录因子在其发育和胚胎发育过程中的重要作用等。此外在拟南芥种子结构研究中，普遍采用光学显微镜以及电子显微镜来观察拟南芥种子内部结构，无法构建完整种子的三维立体图像、获得内部各组织结构详细的参数数据。显微ct虽然能够构建拟南芥种子的三维图像，但由于其内部各组织之间、各细胞之间、细胞与周围环境之间没有明显的密度差异，重构得到的三维图像成像质量较差，无法用于进一步分析拟南芥种子内部参数。因此，提高拟南芥种子内部的成像对比度对于研究其胚胎发生、发育等机理具有重要意义。

microct(micro-computedtomography，micro-ct)，又称为微型计算机成像断层技术、x射线微断层技术，是一种高分辨率的非侵入、非破坏性的ct，能够在不破坏样本的情况下，利用x射线全方位扫描样本，获得样本的三维图像，从而进一步分析样本内部的组织甚至细胞结构与几何信息。micro-ct因其具有高分辨率、成本低廉、操作简单与无损成像等优点，使得该技术在生物学、医学、地质学、材料学等领域获得广泛应用。在生物学领域中，micro-ct最早应用于小动物三维解剖结构信息分析，将小鼠、大鼠或兔子等小动物麻醉后进行活体成像，从而实验生理代谢功能的纵向研究。而micro-ct在植物组织中的应用较少，仅有研究植物托叶、花的三维结构以及茎秆中淀粉含量的测定等，而在细胞水平的研究鲜有报道。因此提高microct技术在植物组织中的成像质量，对植物三维重构、架构探索以及细胞层次的分析等研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决拟南芥种子三维图像成像质量较差，无法用于进一步分析拟南芥种子内部参数的问题，而提供一种提高拟南芥种子成像质量的方法。

为达到本发明的目的，本发明的提高拟南芥种子成像质量的方法，按以下步骤进行：一、溶液的配制：配制标准固定液，取质量分数为37％-40％的甲醛、冰醋酸、体积分数为70％-80％的酒精和甘油按1:(1-2):(10-20):(1-2)的体积比倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液；配制碘化铯溶液，称取8g-12g碘化铯粉末，溶于100ml-200ml的蒸馏水中，得到碘化铯溶液，所述碘化铯溶液现配现用；

二、拟南芥种子的处理：利用移液器按体积比为1:(1-2)分别吸取碘化铯溶液与标准固定液至离心管中，吹吸混匀；然后使用尖头镊子小心划开成熟的拟南芥果夹，将角果剥落至上述混合液中，用移液器吹打数次；放至真空泵中，18-20kpa真空浸染20-30min，然后4℃-8℃避光浸染7d-10d；之后将样品取出并用体积分数为70％的酒精冲洗2次，然后将样品置于梯度酒精中逐级脱水(以下酒精均为体积分数)，70％酒精，20min→80％酒精，20min→90％酒精，20min→95％酒精，20min→100％酒精，然后4℃无水乙醇中保存，得到处理好的拟南芥种子；

三、拟南芥种子的干燥：将步骤二处理好的拟南芥种子用擦镜纸包好，用订书机封口以防种子流出，然后放置于co2临界点干燥仪中干燥，得到干燥后的拟南芥种子；将干燥好的样品转移至离心管中，并加入硅胶颗粒常温保存以备下一步的扫描；

四、拟南芥种子的微计算断层扫描仪成像：将所得样品经高分辨率台式微计算断层扫描仪(brukerskyscan1172)扫描，开机并启动其操控软件skyscan1172，打开样本舱门，将处理好的样本固定在石蜡台上，最多可一次性固定5个；将载有样本的石蜡台装在200μl离心管中，然后固定在载物台上，关闭舱门；设置电压33-35kv，电流90-120μa，分辨率0.5-0.8μm，像素4000*2664；360°旋转观察，确保扫描过程期间样本始终在视野内，然后开始扫描，拷贝扫描数据；

五、重构图片预处理：打开nrecon-shotcut软件，将扫描后的原始数据导入，点击“action”选择“x/yaliganmentwithareferencescan”进行软件自动化校准，以便补偿由于热变化可能引起的的阶段/源移动。然后点击“preview”启用预览功能，可以发现原始图片的重建参数不是最优的，为了进一步提高图像质量，优化种子内部结构，选择“finetuning”在启动一系列预览的条件下手动进行图像参数微调，直至图像清晰无拖影为止，最后点击“start”进行处理后图像的重构，图像自动根据扫描信息进行三维重叠，软件自动识别扫描图片并叠加，最终形成一套完整的包含拟南芥种子三维坐标信息的立体图像。

优选地，所述配制标准固定液，取质量分数为37％-40％的甲醛、冰醋酸、体积分数为70％-80％的酒精和甘油按1:1:18:1的体积比倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液。

优选地，所述配制碘化铯溶液，称取10g碘化铯粉末，溶于100ml的蒸馏水中，得到碘化铯溶液。

优选地，所述将角果剥落至上述混合液中，用移液器吹打数次；放至真空泵中，18kpa真空浸染20min，然后4℃避光浸染7d。

优选地，步骤四中所述利用微计算断层扫描仪成像对拟南芥种子进行扫描，其中设置电压为33kv，电流120μa，分辨率0.6μm。

通过本发明提供的方法处理拟南芥种子得到的样品利用imagej(1.51w)软件分别计算未处理与处理后的成熟拟南芥种子纵切面横切面灰度值，通过对比可以发现二者在同一切面的灰度值存在明显差异。根据灰度值添加伪彩后发现处理后种子重构图像对比度明显，可直观的分辨出细胞轮廓。3d峰值图显示处理后的拟南芥种子重构图像峰值显著高于未处理种子。

利用avizo9.0(fei/thermofisher)重构软件进行处理后拟南芥种子结构分析，结果清晰展示了拟南芥横切面中结构，其中包括下胚轴、子叶、种皮、原形成层、基本分生组织和表皮原等。

本发明相对于现有技术的优点：

1.本发明通过配置标准固定液与csi溶液，将二者按比例融合。将成熟拟南芥种子浸泡其中，避光保存一段时间，使其固定的同时进行重金属染色，不仅能够固定种子内部结构，达到初步脱水的效果。此外cs离子通过渗透作用能够进入种子内部，依靠正负电荷吸引力与细胞壁中的带负电荷的果胶相结合，从而同时完成固定与染色的过程。逐级脱水与二氧化碳临界点干燥可以去除细胞间多余的水分与铯离子，增大成像反差。本发明操作方便快捷，染色效果显著，能够使植物种子的显微ct成像清晰，有助于进一步研究植物种子内部的几何数据。

2.显微ct虽然能够构建拟南芥种子的三维图像，但由于其内部各组织之间、各细胞之间、细胞与周围环境之间没有明显的密度差异，重构得到的三维图像成像质量较差，无法用于进一步分析拟南芥种子内部参数。本发明应用染色固定等方法对拟南芥种子进行处理，处理简便且成本较低。使用此发明方法后，microct扫描结果清晰，大幅提高图像质量，十分利用拟南芥种子三维重构的建立，也为拟南芥种子内部参数计算提供可靠数据。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出来了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明利用microct对成熟拟南芥种子成像分析路线示意图；

图2是本发明利用microct对未处理成熟拟南芥种子扫描重构后纵切原始图；

图3是本发明利用microct对处理后成熟拟南芥种子扫描重构后纵切原始图；

图4是本发明利用microct对未处理成熟拟南芥种子扫描重构后横切原始图；

图5是本发明利用microct对处理后成熟拟南芥种子扫描重构后横切原始图；

图6是本发明利用microct对未处理成熟拟南芥种子扫描重构后图像灰度值分析结果图；

图7是本发明利用microct对处理后成熟拟南芥种子扫描重构后图像灰度值分析结果图；

图8是本发明利用microct对未处理成熟拟南芥种子扫描重构后纵切图像3d峰值分析结果图；

图9是本发明利用microct对处理后成熟拟南芥种子扫描重构后纵切图像3d峰值分析结果图；

图10是本发明利用microct对处理后成熟拟南芥种子扫描重构后横切图像3d峰值分析结果图；

图11是本发明利用microct对处理后成熟拟南芥种子扫描重构后横切图像3d峰值分析结果图；

图12是本发明对拟南芥种子扫描重构后图像的结构分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制权利要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步的定义和解释。

第一实施例

请参阅图1的流程图，及图2至图12，本发明的提高拟南芥种子成像质量的方法，按以下步骤进行：一、溶液的配制：配制标准固定液，取质量分数为37％-40％的甲醛、冰醋酸、体积分数为70％-80％的酒精和甘油按1:(1-2):(10-20):(1-2)的体积比倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液；配制碘化铯溶液，称取8g-12g碘化铯粉末，溶于100ml-200ml的蒸馏水中，得到碘化铯溶液，所述碘化铯溶液现配现用；

二、拟南芥种子的处理：利用移液器按体积比为1:(1-2)分别吸取碘化铯溶液与标准固定液至离心管中，吹吸混匀；然后使用尖头镊子小心划开成熟的拟南芥果夹，将角果剥落至上述混合液中，用移液器吹打数次；放至真空泵中，18-20kpa真空浸染20-30min，然后4℃-8℃避光浸染7d-10d；之后将样品取出并用体积分数为70％的酒精冲洗2次，然后将样品置于梯度酒精中逐级脱水(以下酒精均为体积分数)，70％酒精，20min→80％酒精，20min→90％酒精，20min→95％酒精，20min→100％酒精，然后4℃无水乙醇中保存，得到处理好的拟南芥种子；

三、拟南芥种子的干燥：将步骤二处理好的拟南芥种子用擦镜纸包好，用订书机封口以防种子流出，然后放置于co2临界点干燥仪中干燥，得到干燥后的拟南芥种子；将干燥好的样品转移至离心管中，并加入硅胶颗粒常温保存以备下一步的扫描；

四、拟南芥种子的微计算断层扫描仪成像：将所得样品经高分辨率台式微计算断层扫描仪(brukerskyscan1172)扫描，开机并启动其操控软件skyscan1172，打开样本舱门，将处理好的样本固定在石蜡台上，最多可一次性固定5个；将载有样本的石蜡台装在200μl离心管中，然后固定在载物台上，关闭舱门；设置电压33-35kv，电流90-120μa，分辨率0.5-0.8μm，像素4000*2664；360°旋转观察，确保扫描过程期间样本始终在视野内，然后开始扫描，拷贝扫描数据；

五、重构图片预处理：打开nrecon-shotcut软件，将扫描后的原始数据导入，点击“action”选择“x/yaliganmentwithareferencescan”进行软件自动化校准，以便补偿由于热变化可能引起的的阶段/源移动。然后点击“preview”启用预览功能，可以发现原始图片的重建参数不是最优的，为了进一步提高图像质量，优化种子内部结构，选择“finetuning”在启动一系列预览的条件下手动进行图像参数微调，直至图像清晰无拖影为止，最后点击“start”进行处理后图像的重构，图像自动根据扫描信息进行三维重叠，软件自动识别扫描图片并叠加，最终形成一套完整的包含拟南芥种子三维坐标信息的立体图像。

本发明的提高拟南芥种子成像质量的方法与前述实施方式不同的是，所述配制标准固定液，取质量分数为37％-40％的甲醛、冰醋酸、体积分数为70％-80％的酒精和甘油按1:1:18:1的体积比倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液。

第二实施例

本发明的提高拟南芥种子成像质量的方法与具体实施例一中任意实施方式不同的是，所述配制碘化铯溶液，称取10g碘化铯粉末，溶于100ml的蒸馏水中，得到碘化铯溶液。

本发明的提高拟南芥种子成像质量的方法与前述实施方式不同的是，所述将角果剥落至上述混合液中，用移液器吹打数次；放至真空泵中，18kpa真空浸染20min，然后4℃避光浸染7d。

第三实施例

本发明的提高拟南芥种子成像质量的方法与具体实施例一和具体实施例二不同的是，步骤四中所述利用微计算断层扫描仪成像对拟南芥种子进行扫描，其中设置电压为33kv，电流120μa，分辨率0.6μm。

具体实施例1

一、材料的准备：成熟拟南芥植物种子，从人工培养室种植的拟南芥植株上获得，培养室条件为相对湿度80％，恒温24℃，光照强度180μmol/m2/s，光照周期为8h黑暗和16h光照培养；

二、配制溶液：标准固定液的配制，取福尔马林(质量分数为38％的甲醛)5ml、冰醋酸5ml、体积分数为70％的酒精90ml和5ml甘油(丙三醇)倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液；配制碘化铯溶液，称取10克碘化铯粉末，溶于100ml蒸馏水中，得到碘化铯溶液，所述碘化铯溶液现配现用；需要说明的是，标准固定液适用于一般根，茎，叶，花药，子房组织切片。在植物形态解剖研究上应用极广，此固定液最大优点是兼有保存剂作用；

三、拟南芥种子处理：选取成熟拟南芥种子，利用csi溶液与f.a.a固定液的混合液浸染：

1)使用移液器分别吸取100微升10％csi溶液与f.a.a固定液至200微升离心管中，吹吸混匀；

2)使用尖头镊子小心划开拟南芥果夹，将角果剥落至上述混合液中，用移液器吹打数次；

3)放至真空泵中，20kpa真空浸染30min，然后4℃避光浸染7d；

4)将样品取出并用70％酒精冲洗2次，然后进行梯度酒精逐级脱水：70％酒精，20min→80％酒精，20min→90％酒精，20min→95％酒精，20min→100％乙醇，4℃过夜保存(可提前一天做好，保存于无水乙醇中4℃过夜)；

四、拟南芥种子的干燥：将步骤二处理好的拟南芥种子用擦镜纸包好，用订书机封口以防种子流出；然后放置于co2临界点干燥仪中干燥；将干燥好的样品转移至1.5ml离心管中，并加入2粒硅胶颗粒常温保存以备下一步的扫描；

五、拟南芥种子的微计算断层扫描仪(microct)成像：将所得样品经brukerskyscan1172扫描，开机并启动其操控软件skyscan1172，打开样本舱门，将处理好的样本固定在石蜡台上，最多可一次性固定5个。将载有样本的石蜡台装在200μl离心管中，然后固定在载物台上，关闭舱门。设置电压33kev，电流120μa，分辨率0.6μm，像素4000*2664。360°旋转观察，确保扫描过程期间样本始终在视野内，然后开始扫描。

六、重构图片预处理：打开nrecon-shotcut软件，将扫描后的原始数据倒入，点击“action”选择“x/yaliganmentwithareferencescan”进行红场校正，然后选择“finetuning”进行图像参数微调，直至图像清晰无拖影为止，然后开始重构。

对具体实施例1处理得到的拟南芥种子进行重构图像分析与结构分析：通过分别对比图2、图3和图4、图5，可以发现处理后种子重构图像的对比度有明显提高，可直观的分辨出细胞轮廓。利用imagej(1.51w)软件分别计算未处理与处理后的成熟拟南芥种子纵切面横切面灰度值，通过对比图6和图7，可以发现处理前后的成熟拟南芥种子在同一切面的灰度值存在明显差异。通过分别比对图8、图9和图10、图11，可以发现3d峰值图像显示处理后的拟南芥种子重构图像峰值显著高于未处理种子。

利用avizo9.0(fei/thermofisher)重构软件进行处理后拟南芥种子结构分析，结果如图12，图中清晰展示了拟南芥横切面中结构，其中包括下胚轴、子叶、种皮、原形成层、基本分生组织和表皮原等。

综上所述，本发明提供的提高拟南芥种子成像质量的方法microct扫描结果清晰，大幅提高图像质量，十分利用拟南芥种子三维重构的建立，也为拟南芥种子内部参数计算提供可靠数据。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式和实施例仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。