一种中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取装置及其方法与流程

本发明涉及中药质量控制及品种鉴定的方法，尤其涉及一种中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取装置及其在中药挥发油化学成分分析和指纹图谱鉴别方面的应用。
背景技术：
挥发油是草本植物化学成分中的重要组成，在心脑血管系统、中枢神经系统、呼吸系统、胃肠道系统、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒及促进药物吸收等多方面都具有作用，常用来评价中草药的质量优劣和识别。目前挥发油的提取方法主要采用水蒸气蒸馏法。药材中挥发油成分的沸点多在100℃以上，与水不相混溶或仅微溶，当与水在一起加热时，挥发性成分随水蒸气蒸馏而带出，经冷凝后收集馏出液，最后收集一定体积的蒸馏液。该法虽然使用广泛，但也存在一些不容忽视的问题：(1)取样量大。根据中草药中的挥发油成分高低，取样量不尽相同，但是需要50克以上药材。对于珍贵或稀缺样品来说，不可使用传统水蒸气蒸馏法提取挥发油；(2)操作复杂。传统水蒸气蒸馏法需要特定的玻璃器皿和装置来实现油水分离，需要的实验室空间和能耗也较大；(3)挥发油容易损失，重复性较差。传统的水蒸气蒸馏法的挥发油是通过挥发油提取器收集的。但是挥发油产物容易在玻璃壁上粘附，造成挥发油的损失，对实验结果的精密度和重复性造成巨大影响。另外，挥发油的化学成分分析一般采用气相色谱法或者气相色谱-质谱联用法。虽然气相色谱适于分离分析有挥发性物质，但是对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质往往不能直接进样分析。只有将这类物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，才可以符合气相色谱的测定条件。此外，样品的衍生化反应还具有改善分离选择性，克服载体柱壁对样品的吸附，改善样品的峰形，提高检测能力等优点。因此，挥发性化学衍生物的形成在气相色谱中具有重要的应用价值。但是衍生化反应存在以下几个问题：(1)样品用量大，一般需要取用1g以上挥发油样品；(2)反应操作繁琐，衍生化反应往往需要多个离心、加热、过滤的步骤，实验效率较低；(3)有机溶剂使用量大，因为衍生化反应往往存在衍生试剂过量的问题，需要大量使用有机溶剂去除过量的衍生化试剂，以免造成检测困难。因此，寻找能克服传统提取方法弊端的新技术和装置已成为挥发油提取和分析研究的一个新热点。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种结构简单、使用灵活的中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取装置。为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：一种中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取装置，包括提取装置、纯化装置和化学衍生装置，所述提取装置包括馏分引导管，第一加热装置和提取容器，所述提取容器置于第一加热装置内，所述提取容器的上部密封且提取容器内还设有第一磁力搅拌子，所述馏分引导管一端与样品容器连接；所述纯化装置包括分离容器、冷却装置、挥发油引导管、分离中空纤维膜、第一定量注射器和压力调节管，所述分离容器置于冷却装置内，所述分离容器的上部密封且分离容器内还设有第二磁力搅拌子，所述馏分引导管另一端与分离容器连接，所述分离中空纤维膜的中间段位于分离容器内的液体中，且分离中空纤维膜一端和第一定量注射器连接，另一端和挥发油引导管连接，所述压力调节管设有三通阀门，所述压力调节管的一端插入分离容器内，且位于液面上方；所述化学衍生装置包括衍生容器，第二加热装置，衍生中空纤维膜，样品接收瓶，第二定量注射器和分析物引导管，所述衍生容器置于第二加热装置内，所述衍生容器的上部密封且衍生容器内还设有第三磁力搅拌子，所述挥发油引导管的另一端与衍生容器连接；所述衍生中空纤维膜的中间段位于衍生容器内的液体中，且衍生中空纤维膜一端和第二定量注射器连接，另一端和分析物引导管的一端连接，所述分析物引导管的另一端与接收瓶连接。本发明的第二个目的是提供一种中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取方法，采用上述装置，且包括以下步骤：1)中药挥发油的提取将中药、提取溶剂放入提取容器中进行挥发油提取，加热温度为60℃-100℃，提取时间为10min-30min，中药样品用量为1g-5g，提取溶剂用量为样品用量5倍-20倍；2)挥发油的纯化馏分进入分离容器后，进行油水分离，冷却温度范围为0℃-5℃，分离提取同步进行且时间相同，所述的萃取溶剂为正己烷、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯有机溶剂中一种或多种混合，所述的分离中空纤维膜长度为5-20cm，内径为500-600μm，所述的第一定量注射器容积为100μl-500μl；3)挥发油的化学衍生分离完成后，注入正己烷500μl，将分离中空纤维膜内的挥发油冲洗至衍生容器中，衍生容器中内置10％硫酸-甲醇溶液6ml，衍生时间为5min-30min，衍生温度为40℃-70℃，反应结束后，将水浴温度快速将至室温，衍生中空纤维膜长度为15cm，内径为1000μm，萃取溶剂为正己烷，萃取时间是5min，萃取完成后，注入500μl正己烷，用1.5ml的样品接收瓶收集样品；4)色谱分析将化学衍生后的挥发油样品进行色谱分析，色谱分析采用岛津气相色谱-质谱仪gcms-qp2010se，db-5色谱柱，柱始温90℃，维持1min；15℃/min升至230℃，维持2min；3℃/min升至250℃；10℃/min升至270℃维持5min；载气为高纯氦气1ml/min；ei离子源；电子能量70ev；扫描范围m/z45～550，采集方式为全扫描模式。本发明由于采用了上述的串联液相微萃取装置及方法，具有以下的特点：1、制作过程简便可控需要化学衍生的挥发油样品需要多个加热反应、离心、过滤、萃取的步骤，存在过程复杂、前处理时间长、有机溶剂使用量大等问题。本发明的串联液相微萃取方法方便有效，能够实现挥发油萃取、纯化、化学衍生等一体化处理，且可以精准控制前处理过程中的各个因素，能够为需要化学衍生的挥发油成分测定提供方便可靠的样品前处理装置。2、方法应用科学合理目前传统挥发油提取法的样品用量很大，且在挥发油纯化分离和化学衍生过程中存在大量损失，造成重复性差、准确度低、实验效率低等问题。本发明的中药样品用量小，有机溶剂用量少，实现多个处理步骤中挥发油的无损传递，实验准确度高、重复性好，真实有效体现了中药样品挥发油成分组成，能够为珍贵中药样品的质量控制提供技术手段。3、前处理条件灵活调整本发明的实验装置，可针对不同的目标物质和样品，方便选择多种萃取溶剂，通过调整不同的中空纤维膜尺寸、溶剂类型和用量、提取和反应温度，提供多样化的实验数据，满足不同样品的分析要求，方法科学合理，使用方便。4、取材方便前景良好本发明所采用的材料如萃取溶剂是各类实验室常用的实验耗材，中空纤维膜材料应用广泛，可以很方便的得到。通过本发明的制作方法，可以方便的制作出具有液相微萃取性能的挥发油提取、纯化、衍生装置，并且可以多次重复使用，能够为减少样品前处理时间，降低实验费用，发挥积极的作用。附图说明图1为串联液相微萃取装置的结构示意图。图2薏苡仁样品的色谱分析指纹图谱。1-对照谱图，2-河北产薏苡仁样品，3-贵州产薏苡仁样品1号，4-贵州产薏苡仁样品2号，5-贵州产薏苡仁样品3号，6-贵州产薏苡仁样品4号，7-贵州产薏苡仁样品5号，8-福建产薏苡仁样品1号，9-福建产薏苡仁样品2号，10-福建产薏苡仁样品3号，11-云南产薏苡仁样品，12-浙江产薏苡仁样品1号，13-浙江产薏苡仁样品2号。图3草珠子样品的色谱分析指纹图谱。1-对照谱图，2-河北产草珠子样品，3-贵州产草珠子样品，4-贵州产草珠子样品，5-福建产草珠子样品，6-云南产草珠子样品，7-浙江产草珠子样品。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。如图1所示的一种中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取装置，包括提取装置、纯化装置和化学衍生装置。所述提取装置包括馏分引导管1，第一加热装置3和提取容器2，所述提取容器2置于第一加热装置3内，所述提取容器2的上部密封且提取容器2内还设有第一磁力搅拌子4，所述馏分引导管1一端与样品容器连接。所述的第一加热装置的容积在30ml-10l，带有磁力搅拌功能，可以为水浴、油浴、电热加热等加热功能，温度控制范围为-5℃-100℃，加热时间为10min-3h。所述的提取容器用于在一定时间内提取少量中药量的挥发油成分。内置中药样品和水的混合物5、提取溶剂，容积在1ml-2000ml，上部可以密封，材质包括塑料、玻璃等，样品容器容积为5ml-50ml。所述的馏分引导管用于引导馏分8的流出。馏分引导管的材质包括聚四氟乙烯、聚醚醚酮、不锈钢、塑料、玻璃等。长度0.1m-1m，内径1mm-10mm，外径1.2mm-15mm，形状为圆柱体。馏分引导管两端均开口，一端用粘合剂与提取容器连接，另一端用粘合剂与分离容器连接；作为优选，所述的馏分引导管长度为10cm-20cm，内径为5mm-10mm；作为优选，所述的粘合剂为环氧树脂。所述纯化装置包括分离容器10、冷却装置12、挥发油引导管19、分离中空纤维膜9、第一定量注射器6和压力调节管7，所述分离容器10置于冷却装置12内，所述分离容器10的上部密封且分离容器10内还设有第二磁力搅拌子11，所述馏分引导管1另一端与分离容器10连接，所述分离中空纤维膜9的中间段位于分离容器10内的液体中，且分离中空纤维膜9一端和第一定量注射器6连接，另一端和挥发油引导管19连接，所述压力调节管7设有三通阀门，所述压力调节管7的一端插入分离容器10内，且位于液面上方。所述的冷却装置的容积在10ml-10l，带有磁力搅拌功能，带冷却功能，温度控制范围为-5℃-100℃，冷却时间为1-30min。所述的分离容器用于分离纯化馏分中的挥发油成分。内置分离中空纤维膜、馏分8和第二磁力搅拌子。容积在0.5ml-100ml，上部可以密封，材质包括塑料、玻璃等，分离容器的容积为3ml-50ml。所述的分离中空纤维膜用于分离馏分中的挥发油和水。分离中空纤维膜内部为挥发油的萃取溶剂，外部为挥发油和水混合物。分离中空纤维膜长度1-50cm，内径200-2500μm，外径800-1200μm，膜壁孔径0.1-0.5μm，形状为圆柱体，材质为聚丙烯。分离中空纤维膜具有上、下两端口，均开口，一端和第一定量注射器连接，另一端和挥发油引导管连接。内部含有水溶性较差或非水溶性的挥发油萃取溶剂，所述的中空纤维膜长度为5-20cm，内径为500-1000μm。所述的压力调节管用于调节分离容器内的压力。长度1-20cm，内径500-5000μm，压力调节管具有三通阀门，材质为玻璃。压力调节管具有上、下两端口，均开口，压力调节管一端连接大气，另一端在分离容器内，但不接触液面。所述的第一定量注射器用于向分离中空纤维膜内注射挥发油萃取溶剂。容积为20μl-2ml，可以实现定量注射。材质为玻璃。第一定量注射器的针头连接分离中空纤维膜一端，所述的定量注射器容积为100μl-500μl。所述的挥发油引导管用于引导挥发油的流出。材质包括聚四氟乙烯、聚醚醚酮、不锈钢、塑料、玻璃等。长度0.1m-1m，内径1mm-10mm，外径1.2mm-15mm，形状为圆柱体。挥发油引导管两端均开口，挥发油引导管的一端用粘合剂与分离中空纤维膜相连接，另一端用粘合剂与衍生容器相连接，所述的连接管长度为10cm-20cm，内径为5mm-10mm，所述的粘合剂为环氧树脂。所述化学衍生装置包括衍生容器15，第二加热装置17，衍生中空纤维膜14，样品接收瓶18，第二定量注射器13和分析物引导管20，所述衍生容器15置于第二加热装置17内，所述衍生容器15的上部密封且衍生容器15内还设有第三磁力搅拌子4，所述挥发油引导管19的另一端与衍生容器15连接；所述衍生中空纤维膜14的中间段位于衍生容器15内的液体中，且衍生中空纤维膜14一端和第二定量注射器13连接，另一端和分析物引导管20的一端连接，所述分析物引导管20的另一端与接收瓶18连接。所述的衍生容器用于在一定时间内对挥发油成分进行化学衍生。内置挥发油、衍生中空纤维膜、衍生试剂和第三磁力搅拌子，容积在1ml-2000ml，上部可以密封，材质包括塑料、玻璃等，衍生容器容积为1ml-10ml，衍生化反应包括硅烷化法、酯化法、酞化法、卤化法、醚化法、环化法等化学反应。所述的衍生中空纤维膜用于分离衍生化试剂和挥发油。衍生中空纤维膜内部为衍生后挥发油的萃取溶剂，外部为衍生化试剂和未衍生挥发油。长度1-50cm，内径200-2500μm，外径800-1200μm，膜壁孔径0.1-0.5μm，形状为圆柱体，材质为聚丙烯。衍生中空纤维膜具有上、下两端口，均开口，衍生中空纤维膜一端和第二定量注射器连接，另一端和分析物引导管连接。内部含有水溶性较差或非水溶性的挥发油萃取溶剂，所述的中空纤维膜长度为5-20cm，内径为500-600μm。所述的第二定量注射器用于向衍生中空纤维膜内注射挥发油萃取溶剂。容积为20μl-2ml，可以实现定量注射。材质为玻璃。第二定量注射器的针头连接衍生中空纤维膜一端，所述的第二定量注射器容积为100μl-500μl。所述的分析物引导管用于引导蒸汽和挥发油的流出。材质包括聚四氟乙烯、聚醚醚酮、不锈钢、塑料、玻璃等。长度0.1m-1m，内径1mm-10mm，外径1.2mm-15mm，形状为圆柱体。分析物引导管两端均开口，分析物引导管的一端用粘合剂衍生中空纤维膜连接，另一端插入样品收集瓶中，所述的连接管长度为10cm-20cm，内径为5mm-10mm，所述的粘合剂为环氧树脂。所述的样品收集瓶用于收集衍生后挥发油样品，材质包括玻璃等，容积为1ml-5ml。一种中药挥发油提取、纯化和化学衍生的串联液相微萃取方法，采用上述装置，且包括以下步骤：1)中药挥发油的提取将薏苡仁和草珠子各1g和20ml水放入50ml塑料离心管中进行挥发油提取，提取时间为15min，提取温度为100℃；2)挥发油的纯化馏分进入分离容器后，进行油水分离。冷却温度为4℃，分离中空纤维膜长度为15cm，内径为1000μm，萃取溶剂为正己烷。分离与提取同步进行，时间为15min。3)挥发油的化学衍生分离完成后，注入正己烷500μl，将中空纤维膜内的挥发油冲洗至衍生容器中。衍生容器中内置10％(v/v)硫酸-甲醇溶液6ml，衍生时间为10min，衍生温度为60℃。反应结束后，将水浴温度快速将至室温。分离中空纤维膜长度为15cm，内径为1000μm，萃取溶剂为正己烷，萃取时间是5min。萃取完成后，注入500μl正己烷，用1.5ml玻璃样品瓶收集样品。4)传统方法将中药样品100g和2000ml水放入5000ml玻璃烧瓶中进行挥发油提取，提取时间为5h，提取温度为100℃。得到挥发油提取器中的挥发油，为1.6ml。取1ml挥发油加入50ml10％(v/v)硫酸-甲醇溶液，衍生时间为1h，衍生温度为60℃。衍生后加入50ml乙醚，分液后取有机层。加热挥发至干，再加入10ml正己烷溶解残渣。5000rpm离心后，用0.22μm滤头过滤。取1ml样品到样品瓶。5)色谱分析色谱分析采用岛津气相色谱-质谱仪gcms-qp2010se，db-5色谱柱，柱始温90℃，维持1min；15℃/min升至230℃，维持2min；3℃/min升至250℃；10℃/min升至270℃维持5min；载气为高纯氦气1ml/min；ei离子源；电子能量70ev；扫描范围m/z45～550，采集方式为全扫描模式。色谱分析指纹图谱如图2、图3所示。用气相色谱-质谱分别对薏苡仁和草珠子的挥发油成分进行了定性分析比较。表1是传统方法和本发明方法的对比。可以看出本方法的实验效率高于传统方法。表2为薏苡仁和草珠子挥发油指纹图谱相似度结果。表3是薏苡仁和草珠子挥发油成分的结果。gc-ms数据采用指纹技术和化学计量学方法进行处理。使用薏苡仁对照药材谱图作为参考，薏苡仁样品之间的相关系数范围为0.85到0.97，作为一个群体可以容易地从混淆品中分离出来，其混淆品草珠子的相关系数范围从0.10到0.30。从薏苡仁样品共鉴定出38种香味化合物，在混淆品草珠子中鉴定出42种化合物。结果表明本发明结合gc-ms指纹图谱技术可以高度可靠地区分两种草药样品。这种方法对于鉴别其他草药也是实用的。表1传统方法和本发明方法的对比项目传统方法本发明前处理时间7h30min有机溶剂用量110ml1ml样品用量100g1g鉴别色谱峰数目3838表2为薏苡仁和草珠子挥发油指纹图谱相似度结果acs1tocs12:薏苡仁样品；acs1toacs6:草珠子样品b相关系数(i)是用薏苡仁的对照谱图作为参照；c相关系数(ii)是用草珠子的对照谱图作为参照。表3草珠子和薏苡仁挥发油成分a相对含量以范围表示；b–：未检出。本发明用于提取和检测植物挥发油组成，及其在中药品质评价与化学鉴别中的应用，实现中药挥发油快速和简便分析。本发明采用串联中空纤维膜液相微萃取装置，能够实现少量中药样品的挥发油提取，相继实现挥发油的纯化和衍生化过程，主要用于研究中药挥发油的化学组成。其他用于挥发油提取的实验装置在装置构造、工作原理上均与本发明存在明显差异，无法满足样品串联提取和衍生化需要。经检索，未见与本发明类似的专利公开，以及以本发明类似实验装置开展的挥发油分析研究的文献报道。应当指出，以上实施例仅是本发明的代表性例子。本发明还可以有许多变形。凡是依据本发明的实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。当前第1页12