检测人血浆中伏立康唑浓度的HPLC方法与流程

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及一种检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法。

背景技术：

伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药物，临床常用于治疗侵袭性肺曲霉病、念珠菌血症等侵袭性真菌病。该药药代动力学呈现非线性特征，患者年龄、体重、肝功能、基因多态性、合并用药等因素均会影响其体内过程，使得血药浓度个体间和个体内差异较大。伏立康唑血药浓度与临床疗效和安全性存在密切联系，血药浓度过低或过高可能导致的疗效不佳或不良反应增多。目前国内外报道的测定方法主要有hplc法和lc-ms/ms法，日本化疗学会和日本治疗药物浓度学会已明确推荐采用hplc法或lc-ms/ms法用于测定伏立康唑血药浓度。考虑lc-ms/ms法样品处理较为复杂，仪器昂贵，国内医院应用并未普及。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法，建立了hplc法测定人血浆中伏立康唑血药浓度，旨在为临床合理用药提供参考。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：

该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法包括如下步骤：

(1)色谱条件：色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc18(100mm×4.6mm，3.6μm)；流动相∶乙腈-0.01mol·l^-1磷酸二氢钾溶液(35∶65)；流速0.8ml·min^-1；柱温35℃；进样体积15μl；检测波长260nm；

(2)溶液配制：对照品溶液精密称取伏立康唑对照品25mg，甲醇溶解并定容至25ml，得到质量浓度为1.0g·l^-1的伏立康唑储备液，置4℃冰箱冷藏备用；内标溶液精密称取氯唑沙宗10mg，甲醇溶解并定容至100ml，得到质量浓度为100mg·l^-1的氯唑沙宗储备液，置4℃冰箱冷藏备用；

(3)血浆样品处理：精密移取血浆样品200μl，加入100mg·l^-1的氯唑沙宗内标溶液50μl，加入400μl甲醇溶液，涡旋混匀1min后于14000r·min^-1及4℃条件下离心10min，取上清液15μl进样；

(4)伏立康唑和内标氯唑沙宗的保留时间分别为7.86min和4.60min，考察6份不同的空白血浆，结果表明色谱分离良好，血浆中的内源性物质均不干扰血浆中伏立康唑的分析；

(5)取适量伏立康唑储备液，用甲醇定量稀释成系列标准溶液，再加入适量空白血浆制得伏立康唑质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0mg·l^-1的系列标准血浆样品溶液，按步骤(3)处理后，测定伏立康唑峰面积ai，内标锋面积as，以ai/as为纵坐标，所对应各点浓度(ρ)为横坐标绘制标准曲线，经最小二乘法线性回归，得伏立康唑的标准曲线回归方程y＝0.14ρ+0.0028(r＝0.9999)，按rsn＝5确定最低定量限，血浆中伏立康唑的最低定量限为0.2mg·l^-1；

(6)配制伏立康唑质量浓度为0.5、5.0、15mg·l^-1的低、中、高3种浓度血浆样品各5份，按照步骤(3)处理，连续测定3天，计算日内和日间精密度；

(7)配制伏立康唑质量浓度为0.5、5.0、15mg·l^-1的低、中、高3种浓度血浆样品各5份，按照步骤(3)处理，将实测浓度与加入浓度之比作为相对回收率，将实测浓度与相应浓度对照品溶液浓度之比作为提取回收率；

(8)取低、中、高质量浓度的质控血浆样品分别经室温放置12小时、反复冻融3次、自动进样器放置12小时或密闭-20℃低温保存3个月，然后按照步骤(3)操作后进样测定，每次平行测定5份血浆样品，结果表明血样中伏立康唑在室温放置12小时、反复冻融3次、自动进样器放置12小时或密闭-20℃低温保存3个月等条件下回收率均为85％～115％，rsd均＜15％。

采用以上技术方案的有益效果是：该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法操作简便，结果准确，适用于人血浆中伏立康唑的检测，可以帮助避免血药浓度过低或过高可能导致的疗效不佳或不良反应增多。该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法的实验结果符合生物样品的测定要求，适用于临床治疗药物浓度监测及药动学研究。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

图1是伏立康唑的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法的优选实施方式。

图1出示该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法的具体实施方式：

该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法采用的仪器包括：agilent1260型高效液相色谱仪，包括g1311b四元泵、g1329b自动进样器、g1316a柱温箱和g1315ddad检测器；ml204电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；mx-s涡旋混合器(美国scilogex公司)；dm0412s低速离心机(美国scilogex公司)；5418r低温高速离心机(德国eppendorf公司)。

该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法采用的试药包括：伏立康唑对照品(中国食品药物检定研究院，批号100862-200701，纯度≥99.7％)；氯唑沙宗(中国食品药物检定研究院，批号100364-201302，纯度99.7％)；乙腈和甲醇(色谱纯，merck)；磷酸二氢钾(分析纯，上海泰坦化学有限公司)；超纯水由labtoweredi15超纯水系统制得。

该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法包括如下步骤：

(1)色谱条件：色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc18(100mm×4.6mm，3.6μm)；流动相∶乙腈-0.01mol·l^-1磷酸二氢钾溶液(35∶65)；流速0.8ml·min^-1；柱温35℃；进样体积15μl；检测波长260nm；

(2)溶液配制：对照品溶液精密称取伏立康唑对照品25mg，甲醇溶解并定容至25ml，得到质量浓度为1.0g·l^-1的伏立康唑储备液，置4℃冰箱冷藏备用；内标溶液精密称取氯唑沙宗10mg，甲醇溶解并定容至100ml，得到质量浓度为100mg·l^-1的氯唑沙宗储备液，置4℃冰箱冷藏备用；

(3)血浆样品处理：精密移取血浆样品200μl，加入100mg·l^-1的氯唑沙宗内标溶液50μl，加入400μl甲醇溶液，涡旋混匀1min后于14000r·min^-1及4℃条件下离心10min，取上清液15μl进样；

(4)伏立康唑和内标氯唑沙宗的保留时间分别为7.86min和4.60min，考察6份不同的空白血浆，结果表明色谱分离良好，血浆中的内源性物质均不干扰血浆中伏立康唑的分析；空白血浆、对照品、空白血浆加伏立康唑和氯唑沙宗对照品、患者血浆样品的色谱图见图1。

(5)取适量伏立康唑储备液，用甲醇定量稀释成系列标准溶液，再加入适量空白血浆制得伏立康唑质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0mg·l^-1的系列标准血浆样品溶液，按步骤(3)处理后，测定伏立康唑峰面积ai，内标锋面积as，以ai/as为纵坐标，所对应各点浓度(ρ)为横坐标绘制标准曲线，经最小二乘法线性回归，得伏立康唑的标准曲线回归方程y＝0.14ρ+0.0028(r＝0.9999)，按rsn＝5确定最低定量限，血浆中伏立康唑的最低定量限为0.2mg·l^-1；

(6)配制伏立康唑质量浓度为0.5、5.0、15mg·l^-1的低、中、高3种浓度血浆样品各5份，按照步骤(3)处理，连续测定3天，计算日内和日间精密度；结果见表1。

(7)配制伏立康唑质量浓度为0.5、5.0、15mg·l^-1的低、中、高3种浓度血浆样品各5份，按照步骤(3)处理，将实测浓度与加入浓度之比作为相对回收率，将实测浓度与相应浓度对照品溶液浓度之比作为提取回收率；结果见表1。

(8)取低、中、高质量浓度的质控血浆样品分别经室温放置12小时、反复冻融3次、自动进样器放置12小时或密闭-20℃低温保存3个月，然后按照步骤(3)操作后进样测定，每次平行测定5份血浆样品，结果表明血样中伏立康唑在室温放置12小时、反复冻融3次、自动进样器放置12小时或密闭-20℃低温保存3个月等条件下回收率均为85％～115％，rsd均＜15％。

表1.人血浆中伏立康唑测定方法的精密度和回收率

已有文献报道伏立康唑血药浓度测定的内标主要有氟康唑、酮康唑等三唑类抗真菌药物和地西泮、劳拉西泮等精神类药品。这些内标物质可能存在以下问题：1、许多应用伏立康唑的患者可能同时或先前使用过氟康唑等抗真菌药物，加之氟康唑血浆消除半衰期较长，选用氟康唑作为内标物质可能会影响这部分患者的测定；2、地西泮、劳拉西泮等属于国家管制药品，该类标准品不易获得。由于氯唑沙宗与伏立康唑合并使用的情形在临床较为罕见，加之氯唑沙宗消除半衰期短，对药物浓度测定影响较小。此外，加之氯唑沙宗价格低廉，容易获得，可以有效避免以上问题。将氯唑沙宗作为内标用于伏立康唑血药浓度的测定，其与伏立康唑分离度好，对样品测定无干扰，符合内标选择要求。

检测波长的选择与最终的检测限直接相关。已有文献报道检测波长大多介于254～256nm。通过全波长扫描，证明两氯唑沙宗在上述波长范围的响应值偏低，最低定量限仅为0.5mg·l^-1；而检测波长260nm处氯唑沙宗和伏立康唑均能保持较高的响应值，最低定量限达到0.2mg·l^-1，能够满足临床需求，故本方法检测波长采用260nm。

对于血浆样品前处理，文献报道有固相萃取、液液萃取、高氯酸蛋白沉淀等方法。结合本方法的具体条件，采用两倍体积甲醇沉淀蛋白。该检测人血浆中伏立康唑浓度的hplc方法操作简单、成本较低、提取回收率高，可以满足临床大批量样品测定的要求。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。