一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒的制作方法

本发明属于临床肿瘤功能检测和病理诊断领域，涉及一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒。

背景技术：

胰腺癌是一种致死率极高的肿瘤，其发病率和死亡率几乎一致。胰腺癌在美国癌症死亡率中占第四位，在欧洲占第五位(siegeletal.,2016)。近几十年来，我国胰腺癌的发病率和死亡率快速上升(马臣etal.,2013)。据2017中国癌症报告，胰腺癌已成为大城市人口死亡的主要五大肿瘤之一。目前，胰腺癌的主要治疗方法仍是手术切除。尽管胰腺癌的手术技术已有长足进步，但其术后的长期生存率仍十分有限(vincentetal.,2011)。术后大部分病人会接受辅助化疗，但超过70％的病人在术后1年内复发或更短时间内复发。在临床实践过程中，预测胰腺癌病人术后复发风险是一件极难的工作。复发的风险等级对胰腺癌病人的术后治疗方案的制定和随访具有很高的指导意义。可惜的是，目前没有一个临床上可以用的可靠指标。目前，胰腺癌的转移、复发预测大部分仍依赖传统的指标如血清ca19-9、span1、淋巴结转移、肿瘤分化程度等(hosokawaetal.,2017；kimetal.,2016)。但预测的敏感性和特异性都不佳，如果能找到更好的预测胰腺癌复发指标，对胰腺癌的治疗和判断预后有着重要的意义，并能给患者带来生存获益。

病理学诊断是诊断“黄金标准”。病理学诊断技术依赖组织的平面结构做出诊断，组织的平面结构无法提供组织内部细胞在空间中的立体状态，例如细胞突起和细胞之间相互作用等功能相关信息。然而，这些功能相关信息中可能包含了许多肿瘤独特行为或功能的信息。为了探索这些功能相关信息，本发明人通过技术创新和长时间摸索，建立了一套病理切片3d免疫荧光染色技术。这项技术弥补了传统病理学的不足之处，3d免疫荧光染色不仅提供清晰的组织结构图，而且可以显示肿瘤内部细胞之间的空间分布及完整的细胞结构。

在前期研究中，本发明人发现胰腺癌微循环中存在一种特殊的“毛毛虫”似的毛细血管，这些血管内皮细胞基底面有基底微绒毛。基底微绒毛的超微结构和物质运输系统均显示此微绒毛具有物质交换能力(saiyinetal.,2015)。同时，本发明人也观察到了在易复发的胰腺癌中基底微绒毛异常发达，而在不易复发的肿瘤中基底微绒毛相对少。糖摄取能力高的肿瘤微血管基底微绒毛异常长，可以达到血管直径的10倍，有的甚至可以达到胰腺癌导管内部(saiyinetal.,2015)。因此，我们推测基底微绒毛可能是胰腺癌获取营养物质的主要通道，微绒毛的参数，例如长度和密度等，可能反映该肿瘤的细胞的改造微环境的能力，从而获取更多营养的物质。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明人利用激光共聚焦断层扫描技术，重建免疫荧光染色后的81例胰腺癌病人的肿瘤微血管，测量了微血管内皮细胞基底微绒毛的参数，并与病人的术后复发情况进行相关性分析，发现血管内皮细胞基底微绒毛的长度和密度与胰腺癌的复发风险呈高度相关。

进而，本发明提供了一种预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，包括胰腺癌组织切片制作试剂、组织染色试剂，以及肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛的长度高风险阈值和/或密度高风险阈值，所述长度高风险阈值和密度高风险阈值的判定标准为以下三种中的任意一种：

b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值时，判定为复发高风险；

b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险；

c.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值，且平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险。

进一步，所述复发高风险是指根据cox模型，胰腺癌根治术后患者相比复发低风险相对危险度rr＝e^β，rr>1。

或者，所述复发高风险的平均复发率高于所述复发低风险的平均复发率，优选为1.2倍以上或1.6倍以上，进一步优选为2倍以上或3倍以上。

优选地，所述长度高风险阈值为11.14-11.87μm；在本发明的一种优选实施方式中，以基底微绒毛平均长度作为判定标准，其长度高风险阈值为11.87μm；在本发明的另一种优选实施方式中，以基底微绒毛中位数长度作为判定标准，其长度高风险阈值为11.14μm。

优选地，所述密度高风险阈值为334-361个/mm²；在本发明的一种优选实施方式中，以基底微绒毛平均密度作为判定标准，其密度高风险阈值为361个/mm²；在本发明的另一种优选实施方式中，以基底微绒毛中位数密度作为判定标准，其密度高风险阈值为334个/mm²。

进一步，本发明提供了cox比例风险回归模型h(t,x)＝h0(t)exp(βx)，其中x为微绒毛长度(单位：μm)或微绒毛密度(单位：个/mm²)，β为回归系数，t为时间点(单位：天)，h0(t)为基准风险函数，理解为基准人(例如低风险患者)的风险函数；h(t,x)表示具有x微绒毛长度的患者，在时间点t的复发风险率，h(t,x)越大风险越大，h(t,x)越小风险越小。其中，x可以为微绒毛平均长度或中位数长度，也可以为微绒毛的平均密度或中位数密度。胰腺癌根治术后患者相比复发低风险的相对危险度rr＝e^β，rr>1为高风险。

在本发明的一种优选实施方式中，以基底微绒毛平均长度作为判定标准，高风险阈值为11.87μm，此时β＝1.315，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^1.315＝3.724，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度大于11.87μm时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是平均长度小于11.87μm患者的3.724倍。

在本发明的另一优选实施方式中，以基底微绒毛中位数长度作为判定标准，高风险阈值为11.14μm，此时β＝1.244，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^1.244＝3.470，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛中位数长度大于11.14μm时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是中位数长度小于11.14μm患者的3.470倍。

在本发明的又一优选实施方式中，以基底微绒毛平均密度作为判定标准，高风险阈值为361个/mm²，此时β＝0.476，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^0.476＝1.609，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度大于361个/mm²时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是平均密度小于361个/mm²患者的1.609倍。

在本发明的再一优选实施方式中，以基底微绒毛中位数密度作为判定标准，高风险阈值为334个/mm²，此时β＝0.205，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^0.205＝1.228，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度大于334个/mm²时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是中位数密度小于334个/mm²患者的1.228倍。

优选地，选择胰腺癌组织中微绒毛最多的微血管测量微绒毛的长度和/或密度。

优选地，所述组织切片为组织厚切片，厚度优选为40-50μm。

优选地，所述组织染色是3d免疫荧光染色。

进一步，本发明所述预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒还包括图像分析软件；优选为imagej软件。

在本发明的一种优选实施方式中，采用激光共聚焦显微镜对染色后的组织进行扫描拍照，然后采用imagej软件对图像中的微绒毛进行分析，微绒毛的长度测量采用分段线(segmentedline)勾画出长度，然后进行测量，微绒毛计数使用细胞计数(cellcounter)功能进行。

优选地，所述胰腺癌组织切片为冰冻切片，所述胰腺癌组织切片制作试剂包括4％(m/v)多聚甲醛(pfa)溶液、30％(m/v)蔗糖/pbs溶液。

进一步，所述组织染色试剂包括蛋白抗体和荧光显色抗体，优选为双荧光染色试剂，所述蛋白抗体可选自cd34抗体、糖转运蛋白-1(glut-1)抗体和细胞胶质蛋白(ck)抗体中的任意两种。

进一步，所述预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒还包括至少一种以下试剂：0.01mpbs、封闭液、孵育液、水溶性防催灭封片剂。

优选地，所述封闭液为含10％驴血清和0.2％tritonx-100的0.01mpbs，所述孵育液为含5％驴血清和0.2％tritonx-100的0.01mpbs。

本发明采用组织厚切片血管内皮细胞基底微绒毛的免疫荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜3d重建技术，定量测定胰腺癌微血管内皮基底微绒毛各种参数，得到了完整和清晰的胰腺癌肿瘤微循环结构及血管内皮基底微绒毛病理形态结构。根据前期实验结果，基底微绒毛增强了血管与肿瘤细胞之间的葡萄糖转运，基底微绒毛采取高效的囊泡运输方式在肿瘤细胞间进行能量物质的摄取和投送，预测胰腺癌基底微绒毛可能是肿瘤细胞改造微循环系统从而获得更多营养物质的形成的特殊结构，形成的突起越长细胞的代谢能力越强，而代谢能力强的肿瘤细胞具有高转移性和侵袭性。研究发现胰腺癌基底微绒毛的长度和密度与最大标准摄取值(suvmax)相关性最强；suvmax值越高，肿瘤内的微绒毛密度越高、长度越大，反之亦然；同时，随着suvmax值增加基底微绒毛分支也会有所增多。基底微绒毛与肿瘤pet-ctsuvmax值的相关性提示胰腺癌基底微绒毛具有潜在的临床意义和预后指导价值，进而本发明人根据胰腺癌基底微绒毛与复发风险之间的关系提供了预测复发风险的试剂盒。

本发明提供的预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒具有以下有益效果：

1、临床上，物理参数具有稳定性强、重复性高、使用方便等优点，基底微绒毛长度和密度是可以测量的物理参数，可以显示肿瘤细胞的转移和侵袭能力，将有助于胰腺癌病人的诊断、术后治疗方案的制定及预测复发风险；

2、病理学诊断是医学的“金”标准。基底微绒毛的检测技术是传统的病理学学技术的延伸，且微血管内皮细胞基底微绒毛只存在于恶性肿瘤内，该指标是病理学技术指标，属于肿瘤诊断“黄金标准”范围；临床实践中有很好的推广性、实用性及准确性；

3、本发明具有非常好的延伸潜力，可以与肿瘤免疫学指标、肿瘤细胞特异性抗体、间质特异性指标联合应用，可以全方位体现肿瘤的内部的病理变化和代谢和功能改变。帮助医生做出更好的治疗方案和对策，给病人带来更多临床获益。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明实施例中微血管内皮细胞基底微绒毛计数方法示意图；

图2是本发明实施例中微血管内皮细胞基底微绒毛长度测量方法示意图；

图3是不同复发时间(小于94天和大于365天)的患者胰腺癌组织内的微血管内皮细胞基底微绒毛的分布比较照片；这组图显示了8个胰腺癌患者的肿瘤中微绒毛最多的4个微血管；可以观察到微绒毛的长度，容易复发的病例均有很长的基底微绒毛；一年内不复发病例微绒毛明显短且少；靶尺：20μm。

图4是复发时间与基底微绒毛长度之间关系的比较图，其中(左)微绒毛长度低于阈值(11.14μm)为实线，高于阈值(11.14μm)为虚线；(右)微绒毛长度低于阈值(11.87μm)为实线，高于阈值(11.87μm)为虚线；

图5是复发时间与基底微绒毛密度之间关系的比较图，其中(左)微绒毛密度低于阈值(6.08，334.1个/mm²)为实线，高于阈值(6.08，334.1个/mm²)为虚线；其中(右)微绒毛密度低于阈值(6.57，361.0个/mm²)为实线，高于阈值(6.57，361.0个/mm²)为虚线。

具体实施方式

实施例1预测胰腺癌的术后复发风险试剂盒

本实施例提供一种预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，包括：

1)溶液：4％多聚甲醛、含30％蔗糖的0.01mpbs、0.01mpbs、含10％驴血清和0.2％tritonx-100的0.01mpbs、含5％驴血清和0.2％tritonx-100的0.01mpbs；

2)抗体：cd34抗体(abcam公司，#8536)、glut-1抗体(abcam公司，#18356)、免疫荧光二抗(invitrogen公司，alexa-555标记的驴抗小鼠二抗和alex-488标记的驴抗兔二抗)；

3)血清：驴血清(sigma公司)

4)水溶性防催灭封片剂：fluoromount-g荧光封片剂(southernbiotechnology公司)；

5)图像分析软件：imagej；

6)肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均和中位长度高风险阈值优选为11.87μm和11.14μm，平均和中位密度高风险阈值为6.57(361个/mm²)和6.08(334个/mm²)。时间单位为天。其中，根据我们图像分析处理软件的操作步骤，微绒毛计数使用细胞计数(cellcounter)菜单的计数功能，其界面的大小按软件默认设定为1024×1024像素，即134.95μm×134.95μm，换算成个/mm²的单位需除以1.82×10^-2；例如6.57/(1.82×10^-2)＝361.0个/mm²；6.08/(1.82×10^-2)＝334.1个/mm²。

判定标准为以下三种中的任意一种：

c.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值时，判定为复发高风险；

b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险；

c.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值，且平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险。

实施例2采用实施例1中的试剂盒处理肿瘤组织样本

1、人胰腺癌组织标本收集

病理科医生或外科医生收集肿瘤标本，所收集的肿瘤组织的长度0.5-1.2cm、宽度0.5-1.2cm、厚度0.2-0.5cm。肿瘤取样时，尽量靠近肿瘤中心部分，可以不取肿瘤周围组织。取样后，快速放入新鲜配制的4％多聚甲醛(pfa)中固定，然后放入4度冰箱保存和运输，固定24-48小时，然后放入30％蔗糖/pbs(磷酸缓冲溶液)中进行脱水过夜。

2、肿瘤组织厚切片的制作

肿瘤组织从30％蔗糖/pbs溶液中取出，用冰冻切片机制作45μm厚度的切片。

3、切片染色

①将组织切片放入0.01mol的pbs中清洗三次，然后将悬浮漂片放入封闭液(含10％驴血清和0.2％tritonx-100的0.01mpbs)中室温封闭一个小时；

②将封闭后的组织切片移入加有一抗的孵育液(含5％驴血清和0.2％tritonx-100的0.01mpbs)内，在4℃摇床上孵育过夜；

③将孵育后的组织切片在0.01mol的pbs溶液中洗涤6次，每次10分钟，然后移入加有相应荧光二抗和dapi的孵育液中，室温摇床上孵育2个小时或4℃摇床上孵育过夜；

④孵育完后再用pbs在摇床上洗涤6次；

⑤洗完以后，将组织切片移到载玻片上，利用水溶性封片剂封片；

⑥室温避光过夜，然后进行观察和扫描。

实施例3图像处理及标准曲线建立

我们用6-12张cd34和糖转运蛋白-1(glut-1)或细胞角蛋白(cytokeratin，ck)抗体免疫荧光双染的切片扫描一个胰腺癌病人微循环内皮细胞基底微绒毛，用glut-1抗体或ck抗体的染色来确定肿瘤细胞的位置和部位。

利用zeiss710激光共聚焦显微镜读一个病人的5-8个免疫荧光染色的肿瘤切片，读完荧光切片后，确定肿瘤组织内微血管微绒毛最多的5-15个微血管进行计数、测量和计算。

显微镜扫描参数：像素(pixel)：1024×1024，线性(liner)：2；z-stack间距：1μm；扫描速度：5；数字偏移(digitaloffset)：100-250；组织之间会有一定的染色背景差异，因此其它参数可以根据需求进行调整。

图像分析处理软件：imagej(nci)和zen2009(zeiss，德国)。

用zen2009获取多张肿瘤微血管内皮基底图片，用imagej软件对获取的图片进行z-轴叠加z-stacked(maximumintensity)，使基底微绒毛变得清晰，保证测量前能见到完整的微血管基底微绒毛结构，然后测量微血管的表面面积，计数微绒毛数量并测量微绒毛长度。微绒毛计数使用细胞计数(cellcounter)菜单的计数功能(见图1)；长度测量使用分段线(segmentedline)勾画出长度然后进行测量(见图2)。

采用spss20.0软件进行统计分析，选择生存分析方法中的kaplan-meierestimate和coxproportionalhazardsmodel，将胰腺癌患者术后复发情况与微血管基底微绒毛密度和长度的均值和中位数进行相关性分析，建立标准曲线。

本发明提供了cox比例风险回归模型h(t,x)＝h0(t)exp(βx)，其中x为微绒毛长度(单位：μm)或微绒毛密度(单位：个/mm²)，β为回归系数，t为时间点(单位：天)，h0(t)为基准风险函数，理解为基准人(例如低风险患者)的风险函数；h(t,x)表示具有x微绒毛长度的患者，在时间点t的复发风险率，h(t,x)越大风险越大，h(t,x)越小风险越小。其中，x可以为微绒毛平均长度或中位数长度，也可以为微绒毛的平均密度或中位数密度。

以基底微绒毛平均长度作为判定标准，高风险阈值为11.87μm，此时β＝1.315，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^1.315＝3.724。

以基底微绒毛中位数长度作为判定标准，高风险阈值为11.14μm，此时β＝1.244，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^1.244＝3.470。

以基底微绒毛平均密度作为判定标准，高风险阈值为6.57，此时β＝0.476，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^0.476＝1.609。

以基底微绒毛中位数密度作为判定标准，高风险阈值为6.08，此时β＝0.205，其平均效果为相对危险度(rr)＝e^0.205＝1.228。

实施例4胰腺癌的术后复发风险预测结果

我们入组了81例胰腺癌病人，完成基底微绒毛参数的测量之后，我们对这些接受手术治疗的病人进行跟踪随访。基底微绒毛参数与胰腺癌病人的术后复发相关性分析发现，肿瘤内部微血管基底微绒毛长度的均值和中位数越长，胰腺癌病人术后越容易复发(log-rank，p<0.001)。图3显示了术后无病生存期小于92天(左)与大于365天(右)的患者的肿瘤微血管基底微绒毛长度的比较，显示了不同复发时间的患者胰腺癌组织内的微血管内皮细胞基底微绒毛的分布特点；图4显示了基底微绒毛长度越长，术后无病生存期越短，而基底微绒毛长度越短，术后无病生存期越长的结果；图5显示了基底微绒毛密度越高，术后无病生存期越短，而基底微绒毛密度越低，术后无病生存期越长的结果。血管基底微绒毛长度的均值和中位数危险系数(hr)分别是3.724(95％ci，1.948～7.118)和3.470(95％ci，1.829～6.581)。这指标优于常用复发风险的传统的病理解剖学指标有无淋巴结转移1.671(95％ci，0.889～3.139)、神经浸润0.554(95％ci，0.283-1.084)、大血管侵犯2.548(95％ci，1.359-4.779)及肿瘤糖代谢指标petsuvmax值2.756(95％ci，1.459-5.204)。此外，基底微绒毛长度指标预测胰腺癌病人术后复发潜力优于细胞增殖指标ki67指数1.861(95％ci，1.047～3.308)和血清ca19-9和cea指标。这结果显示微血管基底微绒毛长度的均值和中位数具有很好的预测胰腺癌术后复发风险的能力。在临床实践中，能为胰腺癌的术后治疗和判断预后提供指导，为患者带来生存获益。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。