一种显微观察黄蚜小蜂的制片方法与流程

本发明属于蚜小蜂（寄生蜂）显微观察技术领域，具体涉及显微观察黄蚜小蜂（尤其是并胸腹节后缘扇状突）的制片方法。

背景技术：

黄蚜小蜂(aphytis)隶属膜翅目（hymenoptera）蚜小蜂科（aphelinidae）,是介壳虫的重要寄生蜂，在害虫生物防治中发挥重要作用。但是黄蚜小蜂个体微小，需要制作玻片标本进行显微观察和分类鉴定。黄蚜小蜂并胸腹节后缘扇状突的形状、排列是该属分类鉴定的最重要的特征，该特征需要高质量的显微观察才能获得。而目前有关黄蚜小蜂玻片标本的制作方法主要两种：

1.常规的中性树胶封片法：先将标本置于5%氢氧化钾（或5%氢氧化钠）溶液中浸泡，然后水洗20-30min，经过50%、70%、95%、100%等不同浓度酒精脱水，移入丁香油以备制片。制片时把丁香油中的标本挑到盖玻片上（倒置，即腹面朝上），并滴少许丁香油，解剖、整姿后吸干丁香油，加中性树胶封片。常规的中性树胶封片法的不足：中性树胶封片的标本可以永久保存，但不足的是在脱水的过程中标本容易变形或皱缩，清晰度和透明度不够理想，几乎很难看清黄蚜小蜂并胸腹节后缘扇状突的微观结构。

2.荷氏液制片法：标本先经过醋酸乳酸酚浸液（乳酸：结晶酚=10:5制成乳酸酚溶液，然后乳酸酚溶液：冰醋酸=5:7混合而成）处理6-24h，待虫体透明时移到盖玻片上解剖、整姿，然后用荷氏液（12g阿拉伯树胶，20ml水溶化，再加入20-40g水合氯醛和10-20g甘油混合而成）封片。荷氏液制片法的不足：尽管玻片标本清晰度较好，但制作成的玻片标本由于荷氏液属水溶性胶，极易吸湿返潮，所封片的标本不能作永久保存。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种显微观察黄蚜小蜂的制片方法，解决了现有技术中存在制品标本容易变形或皱缩，清晰度和透明度不够理想、很难看清黄蚜小蜂并胸腹节后缘扇状突的微观结构、极易吸湿返潮，所封片的标本不能作永久保存等缺点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种显微观察黄蚜小蜂的制片方法，所述方法包括如下步骤：

（1）100%酒精浸泡、清洗新鲜黄蚜小蜂标本；

（2）将黄蚜小蜂标本放入1.5ml离心管中，加入90ul组织裂解液和10ul蛋白酶k，放入56℃的水浴中，过夜；

（3）将过夜后的溶液吸掉，保留黄蚜小蜂标本，后加入200ul100%酒精；

（4）取一凹形载玻片，将黄蚜小蜂标本连同酒精吸到载玻片凹处，待酒精挥发干净同时加入10ul纯净水，标本背部朝上；

（5）待黄蚜小蜂标本背部表层纯净水挥发干净时，将标本放置于显微镜下显微拍摄扇状突结构；

（6）拍摄结束后，吸掉多余纯净水，滴20ul丁香油淹没黄蚜小蜂标本；

（7）取一普通载玻片，将黄蚜小蜂标本连同丁香油一同移到普通载玻片上，解剖，小心取下头部、触角和翅膀，剩下虫体整姿；

（8）用滤纸吸掉多余丁香油，加一薄层加拿大树胶，使头部、触角、翅膀和虫体固定；

（9）使用40℃烘片机烘24小时；

（10）取上述烘干的标本，逐层加加拿大树胶2-3次，最后使头部、触角、翅膀和虫体分别埋没在加拿大树胶中；

（11）在加拿大树胶未完全凝固前，取圆形盖玻片封片；

（12）使用烘片机40℃烘2周直至烘干，以有效去除胶中的气泡；

（13）将烘干后的标本置于显微镜下观察、拍摄。

所述组织裂解液为10mmtris-hcl，100mmedta，1wt.%sds，ph8.0。

本发明的优点在于：

本技术提案既能够保证黄蚜小蜂标本能够被清晰观察到并胸腹节后缘扇状突的微观结构，并进行拍照鉴定，而且能够保证制作的玻片标本永久保存。

附图说明

图1本发明黄蚜小蜂aphytisholoxanthus(♀)制片图，其中上图为现有技术制片，下图为本发明制片结果；框内为扇状突。

图2本发明黄蚜小蜂aphytisholoxanthus(♀)制片图，其中上图为现有技术制片，下图为本发明制片结果；框内为扇状突。

具体实施方式

实施例1

1.100%酒精浸泡、清洗新鲜黄蚜小蜂标本；

2.将黄蚜小蜂标本放入1.5ml离心管中，加入90ul组织裂解液（10mmtris-hcl，100mmedta，1%sds，ph8.0）和10ul蛋白酶k，放入56℃的水浴中，过夜；

3.将过夜后的溶液吸掉，保留黄蚜小蜂标本，后加入200ul100%酒精；

4.取一凹形载玻片，将黄蚜小蜂标本连同少量酒精吸到载玻片凹处，待酒精挥发同时加入10ul纯净水，标本背部朝上；

5.待黄蚜小蜂标本背部表层纯净水挥发干净时，将标本放置于nikon显微镜（eclipseni-u）下显微拍摄扇状突结构；

6.拍摄结束后，吸掉多余纯净水，滴20ul丁香油淹没黄蚜小蜂标本；

7.取一普通载玻片，将黄蚜小蜂标本连同丁香油一同移到普通载玻片上，解剖，小心取下头部、触角和翅膀，剩下的虫体整姿；

8.用滤纸吸掉多余丁香油，加一薄层加拿大树胶，使头部、触角、翅膀和虫体固定；

9.使用烘片机（40℃）烘24小时；

10.取上述烘干的标本，逐层加加拿大树胶2-3次，最后使头部、触角、翅膀和虫体分别埋没在加拿大树胶中。由于翅膀和触角厚度小，因此加入少量加拿大树胶，2次即可；头部和虫体厚度较大，要逐层加入加拿大树胶3次，使其完全埋没在树胶中以提高观察时的清晰度。

11.在加拿大树胶未完全干燥前，取圆形盖玻片（直径0.6cm）封片；

12.使用烘片机（40℃）烘2周直至烘干，以有效去除胶中的气泡；

13.将烘干后的标本置于nikon显微镜（eclipseni-u）下观察、拍摄。

拍照结果如附图1-2所示，可以看出，本发明黄蚜小蜂标本能够被清晰观察到并胸腹节后缘扇状突的微观结构，并进行拍照鉴定，而且能够保证制作的玻片标本永久保存。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

技术总结
本发明提供一种显微观察黄蚜小蜂的制片方法，通过组织裂解液、酒精、丁香油等处理，解剖后，通过加拿大树胶固定烘干等步骤后，完成制片。本发明方法既能够保证黄蚜小蜂标本能够被清晰观察到并胸腹节后缘扇状突的微观结构，并进行拍照鉴定，而且能够保证制作的玻片标本永久保存。

技术研发人员：王竹红;黄建;司宇;张慧
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2018.08.03
技术公布日：2019.01.04