多蛋白组合物的应用及先天性心脏病筛查试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其是多蛋白组合物的应用及先天性心脏病筛查试剂盒。

背景技术：

出生缺陷是导致婴儿和儿童死亡的第一位原因，而先天性心脏病已经成为我国出生缺陷的首位病种。如何降低先心病发病率，提高先心病治疗疗效已经成为新世纪我国人口健康面临的一个重要挑战。从国际上看，出生缺陷也是威胁儿童生存和生活质量的首位原因。2006年美国发布的“全球出生缺陷报告”中估计全球每年新增加出生缺陷超过800万人，90％发生在中低收入国家。每年大约有330多万的5岁以下儿童死于出生缺陷，有320万的儿童终生都有残疾。其中，先心病位居出生缺陷的首位。

动脉导管未闭(patentductusarteriosus,pda)是先天性心脏病中常见类型。本项目主要研究集中在动脉导管未闭，动脉导管未闭是主肺动脉之间的一种先天性异常通道，由多种因素参与的复杂性疾病，其发病机制尚未完全阐明，主要与血管活性物质、缺氧、离子通道、遗传等因素有关。近年来对pda发病机制的研究主要包括：(1)血液血管舒张与收缩因子水平，前列腺素e(pge)具有舒张血管的作用，胎儿动脉导管(da)的开放是由pge2所维持的，而不是pgi2，与缺氧有关的内皮素(et-1)；间接影响da闭合的血栓素a2(txa2)；(2)血氧浓度增高与胎儿生后da关闭有关；(3)对氧敏感的kv调节心血管组织的反应性，出生时kv基因转换在早产儿da关闭中不仅参与离子通道表达，并能提高对氧的敏感性。另有研究发现pda与5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)基因多态性有关。

与pda有关的病因学及基因学研究虽然已开展较多，但是与疾病相关的蛋白物质与疾病之间的关系并未有较多且深入全面的研究，远远没有达到人们的预期效果。寻找与疾病相关的关键蛋白，更深入、全面、直接的阐明疾病发生机理，在一定程度上可以为临床指导用药、评估治疗效果及预后提供科学证据。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种多蛋白组合物的应用。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种先天性心脏病筛查试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种多蛋白组合物在制备先天性心脏病靶向药物或器械方面的应用，所述多蛋白组合物由血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白组成。

优选的，上述多蛋白组合物的应用，所述先天性心脏病为动脉导管未闭疾病。

优选的，上述多蛋白组合物的应用，所述器械为先天性心脏病筛查试剂盒。

一种先天性心脏病筛查试剂盒，包含6种蛋白检测组：

第一检测组，包括：包被有血小板因子4抗体的多孔板、标准品(血小板因子4纯品)、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，其中，

所述血小板因子4标准品浓度为0,6.25,12.5,25,50,100,200,400ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗血小板因子4抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为86％氯化钠、4.5％磷酸氢二钠、3.5％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，吐温20(0.5％)5ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)取离体血浆样本，检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:100倍稀释后进行检测；

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀；从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；s1为样本稀释液；

3)操作步骤：

a)针对试剂盒设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育3小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色15分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)；

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第二检测组，包括：包被有血管性血友病因子抗体的多孔板，标准品(血管性血友病因子纯品)，生物素标记抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述血管性血友病因子标准品浓度为0,6.25,12.5,25,50,100,200,400ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗血管性血友病因子抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡1分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色8分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第三检测组，包括：包被有纤维蛋白原抗体的多孔板，标准品(纤维蛋白原纯品)，辣根过氧化物酶标记亲和素，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述纤维蛋白原标准品浓度为0,125,250,500,1000,2000,4000,8000ng/ml；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:1000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本50μl，立即加入辣根过氧化物酶标记物工作液50μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育45分钟；

b)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

c)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色15分钟；

d)每孔加终止液50μl，终止反应；

e)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第四检测组，包括：包被有胶原蛋白抗体的多孔板，标准品(胶原蛋白原纯品)，生物素标记抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述胶原蛋白标准品浓度为0,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗胶原蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育3小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色10分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第五检测组，包括：包被有蛋白相关丝氨酸蛋白酶2抗体的多孔板，标准品(蛋白相关丝氨酸蛋白酶2纯品)，生物素标记抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述蛋白相关丝氨酸蛋白酶2标准品浓度为0,23.5,47,94,187.5,375,750,1500pg/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗蛋白相关丝氨酸蛋白酶2抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl10g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:1000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育1.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

第六检测组，包括：包被有纤维连接蛋白抗体的多孔板，标准品(纤维连接蛋白纯品)，生物素标记抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，洗涤液，底物溶液，终止液，其中，

所述纤维连接蛋白标准品浓度为0,12.5,25,50,100,200,400,800ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗纤维连接蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl10g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

上述内容通过常规方法即可制备得到。

上述内容的具体操作方法为：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:500倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色10分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。

本发明的有益效果是：

本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白的检测及功能进行了初步研究，低浓度的血小板因子4以及血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2及高浓度的纤维连接蛋白具有预测先天性心脏病动脉导管未闭的用途，可应用于制备靶向药物来早期干预，同时还可应用于制备先天性心脏病筛查试剂盒，所述试剂盒对预防动脉导管未闭这种疾病有着潜在的巨大应用价值，并且为进一步研究血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2及高浓度的纤维连接蛋白的生物学功能奠定了基础。

附图说明

图1是蛋白质组学检测到的含有血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白的网络互作图；

图2是elisa检测的血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白在先天性心脏病动脉导管未闭患儿及正常对照中的含量；

图3是在人体内血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白对动脉导管闭合的促进作用。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

1.人体血浆样本的收集

所有先天性心脏病患者(实验组)及正常对照儿童(对照组)均在手术前一天早晨，禁食>10h的情况下进行血样采集。每位患者自周围静脉采全血2ml，立即于2500rpm离心10分钟，分离上层血浆。再将分离的血浆分为数等份，置于血浆收集管中，置于-80摄氏度冰箱冻存待检。

2.蛋白质组学检测

1)血浆蛋白质组检测

采用itraq联合多维液相色谱-质谱联用技术(lc-ms/ms)(appliedbiosystems,fostercity,ca)检测两组各混合样本中的蛋白质。

2)样品制备

a)购买高丰度蛋白去除试剂盒(proteoextracttmalbumin/iggremovalkit,calbiochem,usa)，去除高丰度蛋白。

b)加入5倍体积的丙酮，-20℃沉淀1小时。4℃，10000g离心10分钟，

收集沉淀。

c)将干燥后的粉末溶解液于样品裂解液中，30℃恒温水浴充分溶解蛋白。

d)将溶液在室温下15000g离心15min，取上清，并再次离心取上清，充分去除不容性杂质。

e)上清即为组织的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用或直接用于itraq分析。

3)样品定量

样品按定量原理：bca(bicinchoninincacid)与二价铜离子的硫酸铜

等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即bca工作试剂。在碱性条件下，bca与蛋白质结合时，蛋白质将cu2+还原为cu+，一个cu+螯合二个bca分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示最大吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

按照bca方法定量样品中蛋白质。实验步骤如下：

a)以标准蛋白浓度为横坐标，od562为纵坐标制作标准曲线图，求出

回归方程。

b)用od562的值对bsa浓度做标准曲线。

c)取适量体积的待测样品稀释10倍，检测样品吸光度，计算其平均

od562，代入回归方程，最后计算出待测样品的测得浓度，测得浓度乘以10后即为样品的真实浓度。

4)sds-page电泳样品检测实验

a)每个样品取10μg，采用12％sds-page进行分离。

b)分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。具体操作如下：固定2小时；染色12小时；水洗至背景清晰。

c)染色后的凝胶应用imagescanner扫描仪进行扫描，扫描模式为灰度

模式，光密度值为300dpi。

5)蛋白还原烷基化及酶解

具体步骤如下：

a)蛋白定量后每个样品各取100μg，采用5倍体积预冷丙酮进行沉淀，-20℃放置1小时，充分沉淀蛋白。

b)4℃，12,000rpm离心10分钟，取沉淀真空冷冻干燥。

c)采用50μlitraq试剂盒中的dissolutionbuffer充分溶解蛋白沉淀，加入4μlreducingreagent，60℃反应1小时。

d)加入2μlcysteine-blockingreagent，室温反应10分钟，将还原烷基化后的蛋白溶液加入10k的超滤管中，12,000rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液。

e)加入100μldissolutionbuffer，12,000rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次。

f)更换新收集管，在超滤管中加入50μl浓度为50ng/μl的测序级胰蛋白酶溶液，37℃反应12小时。

g)12,000rpm离心20分钟，收集酶解后肽段，在超滤管中再加入50μl

dissolutionbuffer，12000rpm离心20分钟，收集管底溶液并与前次溶液合并。

6)蛋白标记及质谱预实验

a)从冰箱中取出itraq试剂，平衡到室温；

b)将itraq试剂离心至管底；

c)用150μl异丙醇溶解itraq试剂；

d)取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中，加入itraq试剂后室温反应2小时；

e)加入100μl水终止反应；

f)混合所有标记样品，涡旋振荡，离心至管底；

g)真空冷冻干燥样品，留作itraq分离鉴定。

7)2d-lc-msms分析反相色谱分离

a)冷冻干燥后的样品用110μl流动相a溶液溶解；

b)肽段分离在agilent1200hplc上进行，购买色谱柱agilent公司色谱柱，具体参数为：保护住芯：analyticalguardcolumn4.6*12.5mm5-micron.分离柱：narrow-bore2.1*150mm5μm，检测波长：紫外210nm和280nm；流速：0.3ml/min，非线性二元梯度。

肽段色谱分离流动相比例时间表见表1。

表1

c)0-5分钟丢弃，6-45分钟每4.5分钟收集1管，46-50分钟收集成1管，总共10管样品溶液，然后将每管溶液彻底冷冻干燥。得到一维分离色谱图。

反向色谱-tripletof分析

a)将阳离子交换分离后冻干的多肽样品重新溶解于nano-rplcbuffera中。

b)在线nano-rplc液相色谱在eksigentnanolc-ultra2d系统(absciex)进行，溶解后的样品以2l/min的流速上样到c18预柱上(100m×3cm，

c18,3μm,)，然后保持流速冲洗脱盐10min。

c)分析柱是c18反相色谱柱(75μmx15cmc18-3μmchromxpeksigent)，实验所用梯度为70min内流动相b由5％升高至35％。

d)质谱采用tripletof5600系统(absciex)结合纳升喷雾iii离子源(absciex,usa)，喷雾电压为2.5kv，气帘气压为30psi，雾化气压为5psi，加热器温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(ida，informationdependentanalysis)，一级tof-ms单张图谱扫描时间为250ms，每次ida循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离(cid)，动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽。

8)数据库检索

数据处理采用含paragonalgorithm算法的proteinpilotsoftwarev.5.0(absciex,usa)软件进行，本次实验使用的数据库为人数据库，数据库来源于uniprot。蛋白质鉴定主要是通过实验串联质谱数据与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，从而得到蛋白质鉴定结果。设置参数如下：

蛋白质组质谱检索参数

sampletype:itraq8plex(peptidelabeled)

cys.alkylation:iodoacetamide

digestion:trypsin

instrument:tripletof5600

database:homosapiens.fasta

searcheffort:thorough

usermodifiedparameterfiles:no

蛋白质组学检测到的含有血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白的网络互作图见图1。

实施例2

酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)

采用elisa法在验证组血浆样本中对蛋白质组学结果中筛选出的血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白进行验证。实验原理：待测蛋白的抗体预埋于96孔板底部，标准品和样品加入后，其中的待测蛋白会与抗体结合。在去除未结合的基他底物后，加入待测蛋白的生物素共轭抗体。冲洗，加入抗生物素共扼辣根过氧化物酶标记抗体(hrp)，通过冲洗去除未结合的hrp。加入显色剂，终止反应后，测量液体的吸光度。

一种血小板因子4蛋白检测试剂盒，其包含：

包被有血小板因子4抗体的多孔板

标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述血小板因子4标准品浓度为0,6.25,12.5,25,50,100,200,400ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗血小板因子4抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、山羊血清，proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，吐温20(0.5％)5ml加蒸馏水至1000ml。

所述底物溶液:3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：硫酸(2mol/l)。

具体实验操作方法如下：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:100倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育3小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色15分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。结果见图2。

一种血管性血友病因子检测试剂盒，其包含：

包被有血管性血友病因子抗体的多孔板

标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述血管性血友病因子标准品浓度为0,6.25,12.5,25,50,100,200,400ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗血管性血友病因子抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

具体实验操作方法如下：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡1分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色8分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。结果见图2。

一种纤维蛋白原蛋白检测试剂盒，其包含：

包被有纤维蛋白原抗体的多孔板

标准品

辣根过氧化物酶标记亲和素

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述纤维蛋白原标准品浓度为0,125,250,500,1000,2000,4000,8000ng/ml；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

具体实验操作方法如下：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:1000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本50μl，立即加入辣根过氧化物酶标记物工作液50μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育45分钟；

b)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

c)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色15分钟；

d)每孔加终止液50μl，终止反应；

e)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。结果见图2。

一种胶原蛋白检测试剂盒，其包含：

包被有胶原蛋白抗体的多孔板

标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述胶原蛋白标准品浓度为0,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗胶原蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl9.0g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

具体实验操作方法如下：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育3小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色10分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。结果见图2。

一种蛋白相关丝氨酸蛋白酶2蛋白检测试剂盒，其包含：

包被有蛋白相关丝氨酸蛋白酶2抗体的多孔板

标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述蛋白相关丝氨酸蛋白酶2标准品浓度为0,23.5,47,94,187.5,375,750,1500pg/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗蛋白相关丝氨酸蛋白酶2抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl10g，0.5％吐温205ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

具体实验操作方法如下：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:1000倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育1.5小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.2小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色20分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。结果见图2。

一种纤维连接蛋白检测试剂盒，其包含：

包被有纤维连接蛋白抗体的多孔板

标准品

生物素标记抗体

辣根过氧化物酶标记亲和素

生物素标记抗体稀释液

辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液

样本稀释液

洗涤液

底物溶液

终止液

其中：

所述纤维连接蛋白标准品浓度为0,12.5,25,50,100,200,400,800ng/ml；

所述生物素标记抗体为生物素化的抗纤维连接蛋白抗体；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；

所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.2；

所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01m磷酸缓冲液(pbs)ph7.20.05％硫柳汞；

所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％proclin-300，ph值为6-7；

所述洗涤液：nacl10g，0.5％吐温206ml，加蒸馏水至1000ml；

所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；

所述终止液：2mol/l硫酸。

具体实验操作方法如下：

1)血浆样本检测前在4摄氏度环境下过夜融化，2500rpm离心10min，用样本稀释液进行1:500倍稀释后进行检测。

2)标准品制备：将2份标准品离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品(s8)，使用移液器反复吹打至少5次，取1.5ml离心管7枚(s1-s7)，各加入250ul样本稀释液，吸取250μl标准品s8到第一个离心管中(s7)，轻轻吹打混匀。从s7中吸取250μl到第二个ep管中(s6)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。s1为样本稀释液。

3)操作步骤：

a)设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上版贴，37摄氏度温育2小时；

b)弃去孔内液体，甩干；

c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；

e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素标记亲和素工作液100μl，贴上贴膜，37摄氏度温育1.5小时；

f)弃去孔内液体，甩干，按第5步方法洗板3次，甩干；

g)每孔加底物溶液90μl，37摄氏度避光显色10分钟；

h)每孔加终止液50μl，终止反应；

i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(od值)。

4)数据处理：

使用curveexpert(version1.4)软件对od值进行处理，使用标准品od值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔od值代入函数后得到各孔样本浓度值。结果见图2。

综上通过实施例1，发现先天性心脏病动脉导管未闭患儿血浆中血小板因子4的浓度低于正常儿童。血小板因子4是血小板α颗粒中释放的具有70个氨基酸组成的肝素结合蛋白。它在趋化性、凝血、炎症和细胞生长中起着非常重要的作用。血小板因子4低与动脉导管的通畅率有关，其数量低可能导致动脉导管未闭的风险增加。血小板因子4在动脉管腔内具有很强的粘附和聚集能力，在动脉导管解剖闭合的过程中，低血小板因子4影响了细胞的增殖，并阻止导管腔血栓的形成，进而导致动脉导管无法永久闭合。血管性血友病因子，纤维蛋白原及胶原蛋白是大动脉中血小板粘附和聚集过程中最多的黏性基质及关键性的蛋白。在低浓度的血管性血友病因子和纤维蛋白原情况下，可溶性的血浆纤维连接蛋白具有抑制血小板聚集及血栓形成的作用。蛋白相关丝氨酸蛋白酶2可产生凝血酶，并且低浓度的蛋白相关丝氨酸蛋白酶2可以增加新生儿感染的风险，而感染则是动脉导管未闭的一个因素。图3为血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白，蛋白相关丝氨酸蛋白酶2和纤维连接蛋白促进动脉导管未闭的形成的过程。

针对实施例1中蛋白质组学对于先天性心脏病筛查诊断的结果，采用elsia方法再次证实了动脉导管未闭患儿血浆中血小板因子4，血管性血友病因子，纤维蛋白原，胶原蛋白及蛋白相关丝氨酸蛋白酶2的浓度低于正常儿童，纤维连接蛋白的浓度高于正常儿童。结果与实施例1一致，见图2。

上述参照具体实施方式对该多蛋白组合物的应用及先天性心脏病筛查试剂盒进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。