SIRT7的功能与用途的制作方法

本发明涉及药物研发领域，具体公开了sirt7的功能与用途。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染，是一种严重威胁人类健康的重要公共卫生问题，据who报道，全球约20亿人曾感染过hbv，其中3.5亿人为慢性hbv感染者，每年约有100万人死于hbv感染所导致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。尽管疫苗的广泛应用使新发感染者得到明显控制，但也存在接种疫苗失败或者无应答的问题；而目前治疗hbv患者的两大类药物均存在严重的不足，长期服用核苷酸类似物会导致药物抵抗，干扰素价格昂贵并可产生严重的副作用，而且它们均不能完全清除人体内的hbv。因此，寻找新的分子生物学治疗靶点，发展新的治疗策略显得尤为重要。

在hbv感过程中，病毒颗粒通过hbsag与肝细胞受体结合，接着其核心颗粒进入肝细胞，然后脱去核衣壳释放病毒基因组，在细胞核内完成hbvrcdna到hbvcccdna的修复转化，之后cccdna与多种组蛋白、非组蛋白等形成cccdna微染色体，再以cccdna为模板转录形成pgrna，并以此为逆转录模板合成新的子代病毒，从而不断循环。目前，多项研究证实cccdna的表观遗传修饰可以过程调控hbv的复制过程。

sirtuin家族是近来发现的依赖于烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的第ⅲ类组蛋白去乙酰化酶和adp-核糖基转移酶，包括7个家族成员(sirt1-7)，分布在细胞的不同部位，并通过其酶活性参与了细胞多个生理过程的调节，如凋亡、老化、dna损伤修复、线粒体生物合成、脂质代谢、胰岛素分泌、细胞应激反应和炎症反应等。sirt7是sirtuin家族中唯一可定位于核仁和核质的蛋白，也是功能报道最少的一个家族成员。

sirt7对hbv复制和转录的影响，现有技术中未见任何报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供sirt7的功能与用途。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供sirt7上调剂在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

一种实施方式中，所述乙型肝炎治疗药物为hbv慢性感染治疗药物。

所述乙型肝炎治疗药物至少具有以下功用之一：降低hbsag分泌水平、降低hbeag分泌水平、降低hbvdna水平、抑制hbvcore(hbc)蛋白的表达、降低totalhbvrnas水平、降低hbv3.5-kbrna水平、降低totalrnas/cccdna水平、降低3.5-kbrna/cccdna水平、抑制hbv转录、抑制hbvcccdna的转录活性、抑制hbv复制中间体的表达水平、抑制hbv复制。

所述sirt7上调剂是指提高sirt7水平的物质。

具体地，所述提高sirt7水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：

(1)调节sirt7代谢通路以提高sirt7表达水平；

(2)采用过表达方式来提高sirt7表达水平；

(3)于感染hbv的细胞内直接增加sirt7水平。

一种实施方式中，调节sirt7代谢通路可以是采用sirt7激动剂来提高sirt7的活性或促进sirt7转录或表达，从而上调sirt7水平。

提高sirt7的活性是指使sirt7活性提高。优选地，相比提高前，sirt7的活性提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。

促进sirt7转录或表达是指：使sirt7高表达，或者提高sirt7转录活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对sirt7转录或表达进行调控。

优选地，sirt7转录或表达至少提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。

一种实施方式中，可通过转染过表达质粒的形式提高sirt7表达水平。

一种实施方式中，可将sirt7或sirt7模拟物(sirt7mimic)递送至感染hbv的细胞内直接增加细胞内sirt7水平。

本发明实施例已经证实通过转染过表达质粒，过表达sirt7，提高sirt7表达水平，可治疗乙型肝炎。而基于现有技术可知，调节sirt7代谢通路以提高sirt7表达水平以及于感染hbv的细胞内直接增加sirt7水平，均能够提高sirt7表达水平，进而认为这些方法亦可缓解或治疗乙型肝炎。

因此，sirt7上调剂可以是sirt7、sirt7模拟物、sirt7激动剂、sirt7过表达质粒。

所述乙型肝炎治疗药物必然包括sirt7上调剂，并以sirt7上调剂作为前述功用的有效成分。

所述乙型肝炎治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为sirt7上调剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

sirt7上调剂为所述乙型肝炎治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述乙型肝炎治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述乙型肝炎治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述乙型肝炎治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用sirt7上调剂。

所述对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述对象可以是罹患乙型肝炎的患者或者期待预防或缓解乙型肝炎的个体。

sirt7上调剂可以在接受乙型肝炎治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供一种乙型肝炎治疗药物，包括有效剂量的sirt7上调剂。

进一步地，所述乙型肝炎治疗药物，包括有效剂量的sirt7上调剂及药用载体。

所述乙型肝炎治疗药物必然包括sirt7上调剂，并以sirt7上调剂作为前述功用的有效成分。

所述乙型肝炎治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为sirt7上调剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，sirt7上调剂为所述乙型肝炎治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述乙型肝炎治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述乙型肝炎治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述乙型肝炎治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第四方面，提供一种乙型肝炎联合治疗药物组合，包括有效剂量的sirt7上调剂和至少一种其他乙型肝炎治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将sirt7上调剂和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他乙型肝炎治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他乙型肝炎治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将sirt7上调剂和其他乙型肝炎治疗药物配置成复方制剂，在将sirt7上调剂和其他乙型肝炎治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第五方面，提供了一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用有效量的sirt7上调剂以及向对象施用有效量的其他乙型肝炎治疗药物和/或向对象实施其他乙型肝炎治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的sirt7上调剂和至少一种有效量的其他乙型肝炎治疗药物。

基于sirt7为本发明首次发现的乙型肝炎治疗靶点，在与sirt7上调剂以外的其他乙型肝炎治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于乙型肝炎的治疗效果。

其他乙型肝炎治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述sirt7上调剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他乙型肝炎治疗药物可以胃肠道给药或者胃肠外给药。

本发明的第六方面，提供sirt7上调剂在制备具有以下任一项或多项作用的制品中的用途：降低hbsag分泌水平、降低hbeag分泌水平、降低hbvdna水平、抑制hbvcore(hbc)蛋白的表达、降低totalhbvrnas水平、降低hbv3.5-kbrna水平、降低totalrnas/cccdna水平、降低3.5-kbrna/cccdna水平、抑制hbv转录、抑制hbvcccdna的转录活性、抑制hbv复制中间体的表达水平、抑制hbv复制。

所述制品只要能够确切地发挥上述任一项或多项作用即可。所述制品并不限定为必须是药物。

本发明的第七方面，提供sirt7用于筛选乙型肝炎治疗药物的用途。

sirt7用于筛选乙型肝炎治疗药物具体是指将sirt7作为作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物。

将sirt7作为作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物具体是指将sirt7作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到可以提高sirt7表达的物质作为备选的乙型肝炎治疗药物。

一种实施方式中，提高sirt7表达的物质即为sirt7上调剂。

本发明的第八方面，提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，包括步骤：

(1)用候选物质处理表达sirt7的体系；和

(2)检测所述体系中sirt7的表达；

其中，若所述候选物质可提高sirt7的表达，则表明该候选物质是乙型肝炎治疗药物的潜在物质。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，过表达sirt7能够显著抑制hbv复制中间体的表达；过表达sirt7能够显著抑制hbvcore(hbc)蛋白的表达；过表达sirt7能够显著抑制hbsag和hbeag的分泌；过表达sirt7能够显著抑制hbv复制的模板hbv3.5kbmrna表达。综上所述，过表达sirt7能够显著抑制hbv复制。

此外，本发明还首次发现，沉默sirt7能够显著促进hbv复制中间体的表达；沉默sirt7能够显著促进hbvcore(hbc)蛋白的表达；沉默sirt7能够显著促进hbsag和hbeag的分泌；沉默sirt7能够明显促进hbv3.5kbmrna的表达。综上所述，沉默sirt7能够显著促进hbv复制。

基于上述研究成果，本发明首次提供了分离的sirt7基因在在筛选乙型肝炎治疗药物中的用途，并提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：westernblot验证sirt7过表达。

图2a：rt-pcr检测过表达sirt7对hbv3.5-kbrna表达的影响。

图2b：rt-pcr检测过表达sirt7对hbvtotalrnas表达的影响。

图3：rt-pcr验证sirt7过表达对hbv复制中间体的影响。

图4：southernblot检测过表达sirt7对hbv复制中间体表达的影响，其中，rc:不饱和双链dna(rcdna)；ss:单链线性dna(ssdna)。

图5：westernblot检测过表达sirt7对hbc表达的影响。

图6：elisa分析过表达sirt7对hbv抗原分泌的影响。

图7：westernblot检测sirt7沉默效率。

图8a：rt-pcr检测sirt7沉默对hbv3.5-kbrna表达的影响。

图8b：rt-pcr检测sirt7沉默对hbvtotalrnas表达的影响。

图9：rt-pcr验证sirt7沉默对hbv复制中间体表达的影响。

图10：southernblot检测sirt7沉默对hbv复制中间体表达的影响，其中，rc:不饱和双链dna(rcdna)；ss:单链线性dna(ssdna)。

图11：westernblot检测sirt7沉默对hbc表达的影响。

图12：elisa分析sirt7沉默对hbv抗原分泌的影响。

图13：taqman探针rt-pcr分析过表达和干扰sirt7后对hbvcccdna表达的影响。

图14：taqman探针rt-pcr分析过表达和干扰sirt7后对hbvcccdna转录活性的影响。

图15：westernblot检测sirt7在慢性hbv感染小鼠模型中的过表达效率。

图16：elisa检测sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型alt和ast水平的影响。

图17：elisa检测sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型hbsag和hbeag水平的影响。

图18：qrt-pcr检测sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型血清hbvdna水平的影响。

图19：qrt-pcr检测sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型肝组织hbvdna水平的影响。

图20：qrt-pcr检测sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型肝组织hbvrna水平的影响。

图21：taqmanprobespecificpcr检测sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型肝组织hbvcccdna水平的影响。

图22：分析sirt7过表达对慢性hbv感染小鼠模型hbv转录活性的影响。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1实验方法

1.细胞培养和转染方法

hepad38和hepg2-ntcp细胞系培养于含有10％胎牛血清、400μg/mlg418的dmem培养基中，huh-7细胞系培养于含有10％胎牛血清的dmem培养基中，所有细胞均在含5％co2、37℃孵箱中常规培养。质粒按照lipofectamin3000tm(invitrogen)的说明书转染，shrna慢病毒按照吉凯基因慢病毒感染手册进行感染。

2.hbv生产、浓缩和定量

将hepad38接种于10cm培养皿，使用无四环素培养基培养，待细胞达到90％汇合率，开始收集上清，每两天收集一次并更换新鲜培养基，一直收集到细胞有成片脱落时，停止收集。加入终浓度为5％peg8000，4℃旋转过夜，次日4000g离心30min，弃上清，使用无血清(opti-mem)按1:100浓缩倍数重悬沉淀，分装保存于-80℃，浓缩后的病毒使用qrt-pcr进行定量。

3.hbv感染

对hepg2-ntcp细胞系进行hbv感染，细胞以5×10⁵个接种于六孔板，24h后更换为pmm培养基(williamsemedium，10％fbs，5μg/mltransferrin，10ng/mlhegf，3μg/mlinsulin，2mml-glutamine，18μg/mlhydrocortisone，40ng/mldexamethasone，5ng/mlsodiumselenite，2％dmso)，孵育24h后，将收集的hbv病毒与含有5％peg8000的pmm培养基混匀(hbv病毒感染复数为1000)，去除原培养基，加入感染体系，培养24h，pbs洗涤两次后，更换为pmm培养基继续培养。

4.rna、复制中间体、cccdna提取

(1)rna提取：pbs清洗细胞2次，加入1mltrizol裂解液，混匀后，加入200μl氯仿，vortex后，13,000rpmx10min4℃离心，吸取上清，加入等体积异丙醇13,000rpmx10min4℃离心进行沉淀，去除上清后，加入75％乙醇洗涤沉淀，13,000rpmx10min4℃离心后，去除上清并干燥rna沉淀，加水溶解，测浓度后使用tiangen公司fastkingrtkit逆转录rna合成cdna。

(2)复制中间体提取：pbs清洗细胞2次后，加入0.5ml细胞裂解液(10mmtris-hclph8.0，1mmedta，1％np-40，2％sucrose)，混匀后，37℃孵育15min，收集细胞裂解液，15000g离心5min。转移上清，并加入40u/mldnasei和10mmmgcl2，37℃孵育4h后加入200μl35％peg8000(含1.5mol/lnacl)，冰浴1h后11,000gx10min4℃离心，弃上清，加入0.5ml蛋白酶k消化液(0.5％sds，150mmnacl，25mmtris-hclph8.0，10mmedta)和0.5mg/ml蛋白酶k(promega)，45℃水浴过夜。次日等体积酚氯仿抽提，70％乙醇沉淀，te缓冲液溶解hbvdna。

(3)cccdna提取：pbs清洗细胞，加入600μlsds细胞裂解液(20mmol/ltris-hcl，5mmol/ledta，0.4mol/lnacl，1％sds,ph8.0)，加入0.5mg/ml蛋白酶k(promega)，吹打混匀，56℃孵育4h后，酚氯仿抽提2次，70％乙醇洗涤沉淀dna，干燥后用elutionbuffer溶解，取1μgdna用plasmid-safe-atp-dependentdnase(epibio)37℃消化过夜，次日70℃加热30min，使psad酶失活，得到cccdna。

5.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)

(1)检测hbv3.5-kbrna：逆转录rna合成的cdna，按照sybrgreen(bio-rad)说明书配制反应体系和设置反应条件，hbv3.5-kbrna引物为f:ctcttccagccttccttcct(seqidno.1)，r:agcactgtgttggcgtacag(seqidno.2)，totalhbvrnas引物为f:accgaccttgaggcatactt(seqidno.3)，r:gcctacagcctcctagtaca(seqidno.4)。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

(2)检测hbv复制中间体：提取hbv复制中间体，按照sybrgreen(roche,germany)说明书配制反应体系和设置反应条件，hbvdna引物，f：cctagtagtcagttatgtcaac(seqidno.5)，r:tctataagctggaggagtgcga(seqidno.6)。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

6.taqman探针法检测hbvcccdna表达水平

提取的hbvcccdna，按照tiangen公司realmastermix(probe)操作说明书配置反应体系和设置pcr反应条件，hbvcccdna引物f：ctccccgtctgtgccttct(seqidno.7)，hbvcccdna引物r：gccccaaagccacccaag(seqidno.8)，probe：fam-acgtcgcatggagaccaccgtgaacgcc-tam(seqidno.9)，每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

7.westernblot检测

细胞转染3-5天后用ripa裂解细胞，提取细胞总蛋白，bca法测定蛋白浓度。取等量(30μg)细胞总蛋白95℃变性10min，于10％的sds-page中分离蛋白，采用biorad湿式转移电泳槽，以90v电转膜4h，将转移好的nc膜用5％脱脂牛奶封闭1h，后更换为一抗稀释液(1:2000)，4℃摇床孵育过夜。次日以tbs-t洗涤3次，每次5min。加入二抗稀释液(即hrp标记的兔抗人igg抗体，按1：3000稀释)室温下摇床孵育2h，tbs-t洗涤3次后，ecl显影。以gapdh为内参。

8.hbsag和hbeag的检测

按照酶联免疫吸附试验试剂盒(kehua，shanghai)操作说明检测细胞培养上清中的hbsag和hbeag的分泌水平。

9.统计处理

采用spss17.0软件进行统计，两组间比较采用配对t检验和多组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为差异具有统计学意义。

实施例2实验结果分析

1.过表达sirt7对hbv复制的影响

首先，为了验证过表达sirt7对hbv复制的影响，我们将hepad38细胞以5×10⁵个接种于六孔板，24h后分别转染sirt7过表达质粒和对照质粒，5d后裂解细胞，提取细胞蛋白；hepg2-ntcp细胞以5×10⁵个接种于六孔板，24h后更换为pmm培养基，48h感染hbv，72h转染sirt7过表达质粒和对照质粒，7d后裂解细胞，提取细胞蛋白。westernblot证实sirt7在两个细胞系中成功过表达(如图1所示)。

本发明中，sirt7过表达质粒为flag-sirt7，是通过自行构建获得，构建的载体是pcdna3.1-flag，sirt7基因序列是：

atggcagccgggggtctgagccgctccgagcgcaaagcggcggagcgggtccggaggttgcgggaggagcagcagagggagcgcctccgccaggtgtcgcgcatcctgaggaaggcggcggcggagcgcagcgccgaggagggccggctgctggccgagagcgcggacctggtaacggagctgcagggccggagccggcggcgcgagggcctgaagcggcggcaggaggaggtgtgcgacgacccggaggagctgcgggggaaggtccgggagctggccagcgccgtccggaacgccaaatacttggtcgtctacacaggcgcgggaatcagcacggcagcgtctatcccagactaccggggccctaatggagtgtggacactgcttcagaaagggagaagcgttagtgctgccgacctgagcgaggccgagccaaccctcacccacatgagcatcacccgtctgcatgagcagaagctggtgcagcatgtggtgtctcagaactgtgacgggctccacctgaggagtgggctgccgcgcacggccatctccgagctccacgggaacatgtacattgaagtctgtacctcctgcgttcccaacagggagtacgtgcgggtgttcgatgtgacggagcgcactgccctccacagacaccagacaggccggacctgccacaagtgtgggacccagctgcgggacaccattgtgcactttggggagagggggacgttggggcagcctttgaactgggaagcggcgaccgaggctgccagcagagcagacaccatcctgtgtctagggtccagcctgaaggttctaaagaagtacccacgcctctggtgcatgaccaagccccctagccggcggccgaagctttacatcgtgaacctgcagtggaccccgaaggatgactgggctgccctgaagctacatgggaagtgtgatgacgtcatgcggctcctcatggccgagctgggcttggagatccccgcctatagcaggtggcaggatcccattttctcactggcgactcccctgcgtgctggtgaagaaggcagccacagtcggaagtcgctgtgcagaagcagagaggaggccccgcctggggaccggggtgcaccgcttagctcggcccccatcctagggggctggtttggcaggggctgcacaaaacgcacaaaaaggaagaaagtgacgtaa(seqidno.10)。

对照质粒为pcdna3.1-flag，购买于淼灵质粒平台，货号为p0794。

其次，检测了过表达sirt7后对hbv复制的模板hbv3.5-kbrna以及hbv总rnas(totalhbvrnas)表达的影响，rt-pcr分析证实sirt7显著抑制了hepad38和hepg2-ntcp细胞中hbv3.5-kbrna、totalhbvrnas的表达水平，其中hbv3.5-kbrna抑制率分别约为30％和50％，totalhbvrnas抑制率分别为30％和45％(如图2a和如图2b所示)。

再次，提取了hbv复制中间体，通过rt-pcr检测发现在sirt7过表达后hepad38细胞中hbv复制中间体的表达水平下降了约40％，hepg2-ntcp细胞中hbv复制中间体的表达水平下降了约50％(如图3所示)，southernblot检测进一步证实过表达sirt7显著抑制了hbv复制中间体的表达(如图4所示)。

最后，我们也检测了过表达sirt7对hbv蛋白表达的影响，westernblot检测发现sirt7显著抑制了hepad38细胞中hbvcore(hbc)蛋白的表达(如图5所示)，elisa分析发现sirt7也明显抑制了hbsag和hbeag的分泌，抑制率分别约为25％和30％(如图6所示)。

2.sirt7沉默对hbv复制的影响

将hepad38细胞以5×10⁵个接种于六孔板，24h后分别感染靶向沉默sirt7的shsirt7-1、shsirt7-2和shcont慢病毒，5d后裂解细胞，提取细胞蛋白；hepg2-ntcp细胞以5×10⁵个接种于六孔板，24h后更换为pmm培养基，48h感染hbv，72h感染shsirt7-1、shsirt7-2和shcont慢病毒，7d后裂解细胞，提取细胞蛋白。westernblot证实sirt7在两个细胞系中的沉默是有效的(如图7所示)。

上述shsirt7-1所针对的靶序列如seqidno.11所示，具体为：cgaagctttacatcgtgaa。上述shsirt7-1的序列如seqidno.12所示，具体为：gccgaagctttacatcgtgaactcgagttcacgatgtaaagcttcggc。上述shsirt7-2所针对的靶序列如seqidno.13所示，具体为：ggacaccattgtgcacttt。上述shsirt7-2的序列如seqidno.14所示，具体为：

cgggacaccattgtgcactttctcgagaaagtgcacaatggtgtcccg。上述shcont所针对的靶序列如seqidno.15所示，具体为：ttctccgaacgtgtcacgt。上述shcont的序列如seqidno.16所示，具体为：

ttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaa。

其次，我们检测了sirt7沉默对hbv3.5-kbrna及totalhbvrnas表达的影响，qrt-pcr分析证实sirt7沉默明显促进了hbv3.5-kbrna、totalhbvrnas的表达水平，在hepad38细胞中感染shsirt7-1和shsirt7-2慢病毒后hbv3.5-kbrna的表达分别升高约45％和45％，totalhbvrnas表达分别升高约40％和45％；在hepg2-ntcp细胞中感染shsirt7-1和shsirt7-2慢病毒后hbv3.5-kbrna的表达分别升高约30％和40％，totalhbvrnas表达分别升高约40％和40％(如图8)。

再次，提取了hbv复制中间体，通过qrt-pcr检测发现进行shsirt7-1和shsirt7-2慢病毒感染后，hepad38细胞中hbv复制中间体的表达水平分别升高了约40％和40％，hepg2-ntcp细胞中hbv复制中间体的表达水平分别升高了约40％和45％(如图9所示)。southernblot检测进一步证实了sirt7沉默显著促进了hbv复制中间体的表达(如图10所示)。

最后，我们也检测了sirt7沉默对hbv蛋白表达的影响，westernblot检测发现sirt7沉默明显促进了hepad38细胞中hbc蛋白的表达(如图11所示)，elisa分析发现sirt7沉默也明显促进了hbsag和hbeag的分泌，shsirt7-1和shsirt7-2慢病毒感染后hbsag的分泌分别增加约35％和40％，hbeag的分泌分别增加约30％和40％(如图12所示)。

3.sirt7对hbvcccdna表达的影响

hbvcccdna是乙肝病毒前基因组rna复制的原始模板，我们也检测了sirt7对hbvcccdna表达的影响。在hepg2-ntcp细胞感染hbv病毒后，过表达和沉默sirt7后，提取hbvcccdna，taqman探针rt-pcr分析发现hbvcccdna的表达水平没有明显变化(如图13所示，但过表达sirt7后，hbv3.5-kbrna/cccdna的比值(反映cccdna的转录活性)下降了约50％，干扰sirt7后3.5-kbrna/cccdna上升了约30％和40％(如图14所示)。这表明sirt7明显抑制hbvcccdna的转录活性。

4.hbv慢性感染小鼠模型中进一步验证sirt7对hbv转录和复制的影响

我们参照2017年邓强教授课题组发表在hepatology的文献(gaiyunli,etal,hepatology,2017)建立hbv慢性感染小鼠模型，具体如下：分别对50只雄性c57小鼠通过尾静脉高压注射的方式注射4μgprcccdna-shb2m和4μgpcmv-cre质粒，建立hbv慢性感染小鼠模型。

在建模1周后，采集小鼠尾静脉血，提取hbvdna，检测hbvdna水平，选取hbv复制水平相近的雄性hbv转基因小鼠10只，随机将小鼠随机分成2组，每组5只，分别对2组小鼠通过小鼠尾静脉高压注射8μgsirt7过表达质粒flag-sirt7及对照质粒。

sirt7过表达质粒处理1周后，称重，采集小鼠尾静脉血，分离血清，提取hbvdna；同时，我们也提取了10mg小鼠肝组织中的总蛋白、hbvdna、总rna、cccdna。通过westernblot验证sirt7的过表达效率，elisa检测小鼠血样本中alt、ast水平，评估sirt7是否影响小鼠肝脏功能；结果显示，与对照组比较，sirt7在sirt7过表达组4只小鼠中成功过表达(如图15所示)，sirt7过表达组alt、ast水平没有明显变化(如图16所示)。

进一步，我们检测了小鼠血清中hbv复制指标。分别是elisa检测10μl小鼠血样本中的hbsag和hbeag水平，qrt-pcr检测10μl小鼠血样本中的hbvdna水平。结果显示，hbsag分泌水平下降了约25％，hbeag分泌水平下降了约33％(图17)，血清hbvdna水平下降了约59％(如图18所示)。

最后，我们检测了小鼠肝组织中hbv复制指标。分别是qrt-pcr检测小鼠肝组织中的hbvdna水平和hbvrna水平；taqman探针特异性pcr检测小鼠肝组织中cccdna水平，并分析hbvrna/cccdna。结果显示，与对照组比较，sirt7过表达组肝组织中hbvdna水平下降了约47％(如图19所示)，totalhbvrnas水平下降了约39％，hbv3.5-kbrna水平下降了约45％(如图20所示)，hbvcccdna水平没有明显的变化(如图21所示)，totalrnas/cccdna下降了约35％，3.5-kbrna/cccdna下降了约42％(如图22所示)。这部分的实验结果证实在hbv慢性感染小鼠模型中sirt7过表达也能明显抑制hbv转录和复制。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110>重庆医科大学

<120>sirt7的功能与用途

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<170>siposequencelisting1.0

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