建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒的制作方法

本发明属于时间分辨免疫荧光检测技术领域。

背景技术：

急性心肌梗塞(acutemyocardialinfarction,ami)已成为人类死亡的主要原因，由于ami发病急、死亡率高的特点，ami的早期诊断和及时治疗是降低ami死亡率的关键所在。目前，诊断ami主要是根据典型的临床表现，心电图的改变及实验室指标检测。约25％的ami病人发病早期临床症状不明显，约50%ami病人心电图无典型变化，在这种情况下，检测心肌损伤特异性标志物对ami早期确诊就起到了关键性作用，需要研制出一种灵敏度高、特异性好、临床诊断符合率高、快捷方便的检测心肌损伤特异性指标试剂盒。

临床上常检测血液中肌酸激酶mb同功酶（creatinekinase-mb，ck-mb），肌钙蛋白t（cardiactroponint，ctnt），肌钙蛋白i(cardiactroponini，ctni)心肌损伤标记物，判定ami发生。

ck-mb主要存在于心肌细胞中，是常用的心肌损伤标志物之一，ck-mb在ami发病后4〜8h内增高，24h达峰值，两三天恢复正常。血清中ck-mb虽然具有较高的灵敏度，但心肌与骨骼肌中ck-mm有交叉反应，特异性不高，"窗口期"短（开始升高的时间较晚及持续时间较短），ck-mb不是判定心肌组织损伤特异性指标。

技术实现要素：

本发明的目的是采用侧向免疫层析法（lateralflowimmunoassay,lfia）测定血液中mybpc3浓度，能在15分钟内出结果，只需简单设备，能满足快速诊断ami发生要求的建立时间分辨荧光免疫层析法检测mybpc3试剂盒。

本发明包括试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有mybpc3抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

本发明硝酸纤维素膜上包被有mybpc3抗体形成检测线和抗igg抗体形成质控线。

本发明荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm。

本发明荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)元素螯合物中的一种;本发明优先选用铕螯合物(europiumchelate)，其荧光激发波长是420nm，发射波长是615nm。

本发明用时间分辨荧光（trfia）分析仪检测时，在激发光（波长350-430nm）作用后，延时100-400us，再测定试纸卡荧光（波长600-650nm）强度。

本发明mybpc3抗体-荧光微球,选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，用碳二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)处理羧基修饰荧光微球后，mybpc3抗体偶联到上述荧光微球上，mybpc3抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将mybpc3抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用；选用mybpc3抗体识别心肌型mybpc3抗原表位,而不结合骨骼肌型mybpc3抗原。

本发明纯化mybpc3为校准品，用trfia分析仪测定不同浓度mybpc3校准品在试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备mybpc3浓度标准曲线，建立mybpc3浓度标准卡，输入到trfia分析仪，建立trfia分析仪自动显示样品中mybpc3浓度检测系统，用于检测血清，血浆，及全血中mybpc3浓度。

本发明简单，快速，定量检测血液中mybpc3浓度，用于早期诊断ami发生，在临床上有广泛应用，将有很大市场需求。用于判断急性心肌梗塞发生。

附图说明

图1是侧向免疫层析法试纸条侧面图；

图2是包装外壳后侧向免疫层析法试纸卡示意图；图1和图2中1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸水垫，8是样品窗口，9是检测窗口，10是塑料外壳；

图3是mybpc3浓度标准曲线；

图4是mybpc3浓度敏感度曲线；

图5是mybpc3蛋白结构示意图。

具体实施方式

ctnt和ctni(ctn)仅存在于心肌细胞中，可用免疫学方法测定，对心肌损伤的诊断具高度敏感和特异性用于临床诊断ami。ctnt在心肌损伤后3-6小时释放入血，12小时达高峰，升高倍数可达30〜200倍，在血中可维持14天左右，所以它的最大有效诊断窗口宽至2小时-14天。在心肌损伤后，ctnt较ctnl更早释放入血，更易被检测到，血中浓度更高，对检测心肌损伤的价值也就可能更高。

ami理想标志物是在心肌梗死后，从心肌细胞快速释放到血液中，而心脏肌球蛋白结合蛋白c(myosin-bindingproteinc,cardiac-type，mybpc3或cmybp-c)更符合这一标准。

人mybpc3基因位于11号染色体（11p11.2）上，含有35个外显子，编码1273个氨基酸残基组成mybpc3蛋白，属于ⅲ型纤连蛋白超家族和免疫球蛋白超家族，含有３个ⅲ型纤连蛋白结构域（fibronectintype3，fn3）和８个免疫球蛋白样结构域（immunoglobulin,ig），pro-ala结构域（padomain），myosin(s2)结合区（mdomain）。fn3是两片反向平行的β⁃链形成的层状结构，含fn3的多为受体蛋白；ig由约70-110氨基酸组成，是两层反向平行的β⁃折叠链形成的层状结构，看mybpc3蛋白结构示意图。

mybpc3参与肌节蛋白的结构和功能，mybpc3的c10结构域与肌球蛋白纤维结合，而c8～c10结构域结合肌联蛋白（titin），有稳定肌小节结构作用。mybpc3在c1和c2结构域之间有个特定区域，mdomain与肌球蛋白（myosin）颈部结合，也是mybpc3磷酸化部位（phosphorylationsites），作为camp依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点，磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，mybpc3不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。

机体内存在3种不同的mybp-c异构体，通过不同基因编码，但3种mybp-c异构体氨基酸序列有很高同源性.与骨骼肌型mybp-c相比较，心脏型mybp-c的n-端具有独特结构域（c0)并具有特异性抗原表位，可用免疫学方法特异性测定出心脏型mybp-c。

mybpc3是心肌细胞特有的粗肌丝结构蛋白之一，ami发生时，血清mybpc3浓度快升高，主要由于mybpc3具有高度的可溶性及对蛋白水解酶非常敏感，在心肌缺血时，蛋白水解酶被启动并水解粗肌丝蛋白，mybpc3去磷酸化并释放入血，导致血清中mybpc3浓度在短时间内急剧升高。

mybpc3在ami发生后，2小时释放入血，4-6小时达高峰，在12小时，mybpc3恢复至基线水平。

研究发现，需要3-9mg心肌坏死时，能测出ctnt/i水平增高；而0.07mg心肌坏死时，就能测出mybpc3水平增高。由于mybpc3分子量大，在ami超早期，完整的mybpc3及其水解产物持续大量释放入血，能高于ctnt/i数倍，甚至数十倍，易于检测，测定血液中mybpc3浓度，可成为超早期诊断ami敏感和特异性指标。

ami是急症，需要快速诊断和治疗。本发明采用侧向免疫层析法（lateralflowimmunoassay,lfia）测定血液中mybpc3浓度，能在15分钟内出结果，只需简单设备，能满足快速诊断ami发生要求。

本发明试剂盒是利用铕螯合物(europiumchelate)荧光寿命长特征，延时测定，即时间分辨荧光法（time-resolvedfluoroimmunoassay，trfia)，结合侧向免疫层析技术（lateralflowimmunoassay,lfia），实现定量检测mybpc3。本发明试剂盒主要有检测mybpc3试纸卡，由在底板上顺次相互搭接样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，和吸水垫组成试纸条，装在塑料外壳中成为试纸卡。制备方法包括：mybpc3抗体偶联铕螯合物荧光微球;mybpc3抗体-荧光微球喷涂到结合垫上，mybpc3抗体喷涂到硝酸纤维素膜上；加mybpc3校准品到mybpc3试纸卡后，用时间分辨荧光(trfia)分析仪进行检测，建立trfia分析仪自动显示mybpc3浓度检测系统。

本发明选用铕螯合物荧光，荧光寿命长，采用延时测定，排出背景信号；增加检测时间，提高检测敏感性。

本发明包括试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有mybpc3抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

本发明硝酸纤维素膜上包被有mybpc3抗体形成检测线和抗igg抗体形成质控线。

本发明荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm。

本发明荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)元素螯合物中的一种;本发明优先选用铕螯合物(europiumchelate)，其荧光激发波长是420nm，发射波长是615nm。

本发明用时间分辨荧光（trfia）分析仪检测时，在激发光（波长350-430nm）作用后，延时100-400us，再测定试纸卡荧光（波长600-650nm）强度。

本发明mybpc3抗体-荧光微球,选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，用碳二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)处理羧基修饰荧光微球后，mybpc3抗体偶联到上述荧光微球上，mybpc3抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将mybpc3抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用；选用mybpc3抗体识别心肌型mybpc3抗原表位,而不结合骨骼肌型mybpc3抗原。

本发明纯化mybpc3为校准品，用trfia分析仪测定不同浓度mybpc3校准品在试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备mybpc3浓度标准曲线，建立mybpc3浓度标准卡，输入到trfia分析仪，建立trfia分析仪自动显示样品中mybpc3浓度检测系统，用于检测血清，血浆，及全血中mybpc3浓度。

一．建立trfia免疫层析检测mybpc3试纸卡

本发明所述的trfia免疫层析法检测mybpc3试剂盒，含有试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有mybpc3抗体-荧光微球结合垫、喷涂有mybpc3抗体（检测线）和抗igg抗体（质控线）硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽试纸条，将试纸条装入塑料外壳中形成试纸卡。

所述结合垫上吸附的铕螯合物荧光微球，直径范围100-500nm，进一步优选，所选用荧光微球直径是300nm。

所述荧光微球标记镧系元素，包括铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)中的任意一种或几种。进一步优选，所选用镧系元素为铕螯合物(europiumchelate)，在基态下稳定，在420nm激发光源作用下，能够发射出波长615nm荧光。

所述与荧光微球偶联抗体为3个mybpc3单克隆抗体混合，识别心肌型mybpc3抗原表位,不结合骨骼肌型mybpc3抗原；所述检测线的抗体为抗心肌型mybpc3多克隆抗体。

制备mybpc3单克隆抗体-荧光微球

(1)将mybpc3单克隆抗体加到抗体净化和浓缩离心柱中（innovabiosciences）,按说明书步骤，净化和浓缩mybpc3抗体，用磷酸盐缓冲液调节mybpc3单克隆抗体浓度到1.0mg/ml；

(2)用50mmolmes缓冲液(ph6.0)洗涤铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，加入10mmol碳二亚胺(edc)和20mmoln-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，室温下,反应20分钟。

（3）用上述mes缓冲液洗涤微球，用100mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)复溶微球后，加入净化后mybpc3抗体，使mybpc3抗体与微球的质量比为1:40，室温下，反应2小时。

（4）用200mmtris(ph7.5)终止反应。

（5）用0.2%bsa，0.01%tween-20，50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)洗涤微球，再悬浮mybpc3抗体-荧光微球。

制备吸附mybpc3单克隆抗体-荧光微球的结合垫

用10mmtris缓冲液（ph8.0）含0.1%bsa，10%sucrose,0.2%peg,0.2%pvp，0.02%tween20,0.01%nan3复溶mybpc3抗体-荧光微球至需要浓度。本发明选用玻璃纤维结合垫，侵泡在,10mmoltris缓冲液（ph8.0），含0.2%pvp，0.2%peg,10%sucrose,0.02%tween-20，0.01%nan3)，室温下，1小时，再37°c，烘干5小时。将上述玻璃纤维膜放在bio-dotxyz3060三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，5ul-15ul/cm速度，将mybpc3单克隆抗体-荧光微球喷到玻璃纤维膜上，37°c，烘干4小时，加入干燥剂封存备用。

制备有检测线和质控线的硝酸纤维素膜

用10mmtris缓冲液（ph8.0）含0.1%bsa，5%sucrose,0.01%tween20,0.01%nan3溶解mybpc3多克隆抗体和抗鼠igg抗体至需要浓度，将硝酸纤维素膜放在bio-dotxyz3060三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，0.8-1.5ul/cm速度，将mybpc3抗体和抗鼠igg抗体喷到硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线间隔为4-6mm,37°c，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

组装trfia免疫层析法检测mybpc3试纸卡

在底板板上依次粘贴预理样品垫、吸附有mybpc3抗体-荧光微球结合垫、有检测线和质控线硝酸纤维素膜，和吸水垫，得到试纸板，按照要求切割成4mm宽试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

二.建立trfia分析仪检测mybpc3浓度系统

trfia分析仪是一种光学检测系统，可在激发光（350-430nm）作用后，延时100-400us，再测定荧光（600-650nm）强度。对mybpc3检测范围为0.05-200ng/ml。

将校准品放室温平衡，取出mybpc3试纸卡，平放;取20ul校准品，加到样品孔中，反应15-20分钟，用trfia分析仪，测定试纸卡中检测线和质控线荧光强度，制备校准品浓度与荧光强度关系曲线，进一步设置trfia分析仪浓度与荧光强度相关参数后，获得trfia分析仪自动显示mybpc3浓度检测系统。

加血清（20ul），血浆（20ul）,或全血（40μ1）到mybpc3试纸卡样品孔中，反应15-20分钟，用trfia分析仪,选用mybpc3浓度自动显示系统，检测血清，血浆,或全血中mybpc3。

结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步骤实验过程。

一、制备trfia免疫层析法检测mybpc3试剂盒

（一）时间分辨荧光免疫层析法测定mybpc3试纸卡组成

组装试纸卡操作在湿度小于30%，稳定30°c的房间进行。测定mybpc3侧向免疫层析试纸条（图1）包括底板以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于底板上的和样品垫（22mm）、结合垫（10mm）、硝酸纤维素膜（25mm）、吸水纸（30mm）;其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔的由抗mybpc3抗体涂层形成的检测线和由羊抗鼠igg抗体涂层形成的质控线，检测线位于结合垫一侧，质控线靠近吸水纸一侧;结合垫喷涂有mybpc3抗体-铕螯合物荧光微球涂层；吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫之间，依次与相邻部位接触且部分重叠，形成试纸板。

本发明实施例中，检测线与质控线平行设置，检测线与质控线之间的距离为5mm。

吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近质控线一端，且吸水纸一端与硝酸纤维素膜有部分重叠，其重叠部分长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。

结合垫位于硝酸纤维素膜靠近检测线一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。

样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为5mm;样品垫重叠在结合垫上方。

将上述组装成试纸板切割成宽度为4mm试纸条。

将上述结构试纸条装入塑料外壳中构成试纸卡（图2），外壳包括底座和卡盖，卡盖上设置有加样窗口（8）检测窗口（9），露出试纸条局部区域；加样窗口开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开口于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部检测线（5）和质控线（6）。

本发明选用玻璃纤维fusion5样品垫（gehealthcare），侵泡在20mmoltris缓冲液（ph7.5）含0.02%tween-20，0.01%nan3，室温下，1小时，再37°c，烘干5小时，干燥封闭，备用。本发明选用玻璃纤维gfdx结合垫（emdmillipore），侵泡在,10mmoltris缓冲液（ph8.0），含0.2%pvp，0.2%peg,10%sucrose,0.02%tween-20，0.01%nan3)，室温下，1小时，再37°c，烘干5小时，干燥封闭，备用。

（二）mybpc3单克隆抗体化学偶联到铕螯合物荧光微球上

本发明实施例中，选用铕螯合物(europiumchelate)荧光标记羧基修饰微粒（carboxylatedfluorescentmicrospheres），购于oceannanotech,可选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-500nm。

本发明实施例中，选用mybpc3单克隆抗体（invitrogen）,用innovabiosciences公司抗体浓缩和净化离心柱（abselect™antibodyconcentrationandclean-upkit）预处理mybpc3抗体,步骤如下：

1.加500ulmybpc3抗体到抗体浓缩和净化离心柱中，

2.离心，15000g1-4分钟,减少mybpc3抗体到100ul

3.去除收集管中液体,加400ul20mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)到抗体浓缩和净化离心柱中

4.离心，15000g1-4分钟,减少离心柱中液体积到100ul

5.重复3-4步骤，6次以上

6.吸出抗体浓缩和净化离心柱中约100ulmybpc3抗体

7.测定mybpc3抗体浓度，50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)稀释mybpc3抗体到需要浓度

本发明实施例中，用edc和sulfo-nhs把mybpc3抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球（直径300nm）上,步骤如下：

1.取0.4mlcarboxylatedfluorescentmicrospheres(10mg/ml),直径300nmm，加入1.5ml离心管中，离心，10000rpm，5分钟，去除上清液

2.再加入1.0ml50mmolmes缓冲液(ph6.0)到离心管中，悬浮微球

3.离心，10000rpm，5分钟，去除上清液

4.重复2-3步骤2次

5.再加0.5ml50mmolmes缓冲液(ph6.0)含10mmol碳二亚胺(edc)和20mmoln-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)到离心管中,混均，25°c，反应20分钟

6.离心，10000rpm，5分钟，去除反应液

7.加入1.0ml50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)到离心管中

8.离心，10000rpm，5分钟，去除上清液，重复8-9步骤1次

9.加入0.4ml预处理过mybpc3抗体（0.3mg/ml）加入到上述离心管中，25°c，反应2小时

10.加入50ulof0.2mtris(ph7.5)到离心管中，25°c，反应30分钟

11.离心，10000rpm，5分钟，去除上清液，

12.加入1.0ml0.2%bsa，0.01%tween-2050mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)到离心管中

13.离心，10000rpm，5分钟，去除上清液，重复13-14步骤2次

14.用10mmtris缓冲液（ph8.0）含0.1%bsa，10%sucrose,0.2%peg,0.2%pvp，0.02%tween20,0.01%nan3悬浮mybpc3抗体-荧光微球至需要浓度，4°c储存，备用。

（三）．喷涂mybpc3抗体到结合垫和硝酸纤维素膜上

1.将上述制备mybpc3抗体-铕螯合物荧光微球液(0.2mg/ml)，用bio-dotxyz3060仪，用非接触式微定量喷头方式，10ul/cm速度，将mybpc3单克隆抗体-荧光微球喷到玻璃纤维膜上，37°c，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

2.用10mmtris缓冲液（ph8.0）含0.2%bsa，5%sucrose,0.01%tween20,0.01%nan3溶解mybpc3多克隆抗体（2.2mg/ml）和抗鼠igg抗体(0.5mg/ml)，将硝酸纤维素膜放在bio-dotxyz3060仪，用非接触式微定量喷头方式，1.0ul/cm速度，将mybpc3抗体和抗鼠igg抗体喷到硝酸纤维素膜上，两线间隔5mm,37°c，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

二．trfia分析仪检测mybpc3浓度过程

（一）.mybpc3试纸卡操作过程

使用mybpc3试纸卡进行定量检测mybpc3时，在样品垫窗口上加入校准液和样品液（20ul），全血为40ul,在毛细现象作用下，样品液向吸水垫方向泳动，当样品液中含有mybpc3移动到结合垫时，mybpc3与mybpc3抗体-荧光微球结合，形成mybpc3-mybpc3抗体-荧光微粒复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达硝酸纤维素膜检测线处，与包被mybpc3抗体进一步结合，形成mybpc3抗体-mybpc3-mybpc3抗体-荧光微球复合物，聚集在检测线上；而未结合mybpc3抗体-荧光微球继续前移，到达质控线时，此处包被抗鼠igg抗体与mybpc3抗体-荧光微球结合，在质控线处出现抗鼠igg抗体-mybpc3抗体-荧光微球复合物聚集，整个反应在10-20分钟内完成，检测线和质控线都应产生相应的荧光信号，使用trfia分析仪进行检测。

（二）．建立trfia分析仪自动显示检测mybpc3浓度程序

1.建立mybpc3浓度标准曲线

用pbs稀释纯化mybpc3，制成不同浓度mybpc3校准品(0,5，10，20，50，100，200ng/ml),加20ulmybpc3校准品到mybpc3免疫层析试纸卡样品窗口部位，再加150ul实验液（pbs，ph7.4,0.02%tween20）到样品窗口部位，进行膜层析反应，15分钟后，用trfia分析仪,选定激发波长420nm,检测波长615nm，延迟测定时间200us，测定试纸条卡检测线及质控线荧光强度。以mybpc3校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度为横坐标，制备mybpc3校准品浓度标准曲线，得到方程式，y=2.8922x–8.0125，r²=0.9929，看图3，通过此标准曲线得到mybpc3浓度标准卡，作为对样品中所含mybpc3浓度进行定量分析的基础。

。

输入上述标准卡到trfia分析仪，建立自动运行系统，trfia分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中mybpc3浓度。

测定0-5ng/mlmybpc3校准品荧光强度,1-5ng/mlmybpc3校准品荧光强度有线性关系，trfia分析仪测定1ng/mlmybpc3校准品荧光强度（0.97）与0mg/mlmybpc3校准品荧光强度（0.43）相差约2倍，确定此试剂盒trfia分析仪测定mybpc3敏感度为1ng/ml。

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用mybpc3免疫层析试纸卡检测血清中mybpc3浓度

加20ul血清样品到测定mybpc3trfia层析试纸卡加样窗口部位，进行膜层析反应，15分钟后，用trfia分析仪自动检测系统，测定血清样品中mybpc3浓度，结果如下：

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