本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种与性激素异常相关的暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为铅镉混合暴露，其检测方法为基于icp-ms的检测方法。
背景技术：
：：性激素是受下丘脑-垂体-性腺轴调节的类固醇激素的总称。性激素包括雄激素、雌激素、孕激素这几类。性激素的合成及代谢是指在hpt轴的调控下，胆固醇经一系列酶的催化作用后生成孕激素、雄激素、雌激素的过程[1]。。导致性激素异常的原因有居住地区，疾病，环境污染等[2-4]。越来越多的证据表明性腺激素作用对生殖系统和其他系统功能的重要性[5,6]。其中环境毒物由于患者认识不足和检测技术的限制，是较容易被临床所忽略的重要病因。基因组学进行了大量广泛的研究，相对于投入的大量资金及人员，其研究结果对健康的影响并不明显。暴露组学作为基因组学的补充是指从妊娠开始贯穿整个人生的环境暴露(包括生活方式因素).暴露源包括外源(污染、辐射、饮食等)和内源(炎症、感染、微生物等)，继全基因组关联研究(gwas)之后发展的全暴露组关联研究(ewas)的目的是对在未知方式下暴露的评估，ewas方法通过比较患者和健康受试者暴露组的分析结果,确定有效的生物标志物，进而利用这些生物标志物来阐明暴露-效应关系(生化流行病学)、暴露和人体动力学来源(暴露生物学)、以及作用机制(系统生物学)。环境暴露与健康之间的关系研究可从测定病例组和对照组外环境中的空气、水、食物内的污染物入手，检验两组间是否存在差异，进而通过对主要物质的摄入量、代谢等进行考量，估计暴露剂量，这称之为自下而上的方法(bottom-up)；另一种方法是从测量病例组和对照组血液或其他体液内的物质入手，检验各类物质与疾病之间的统计学联系，最终确定导致疾病的物质及其暴露来源，称之自上而下的方法(top-town)。“自下而上”和“自上而下”的方法在识别个体暴露上都具有科学价值，“自上而下”法用于揭示人类疾病的未知暴露源，而“自下而上”法是用于分析外暴露以及建立干预与预防的方法。生物标志物不仅可以用于研究外暴露，也可以用于研究内暴露。内暴露组学采用组学的方法进行研究，如基因组学、蛋白质组学、表观基因组学、代谢组学、转录组学、加合物组学等。暴露组学涉及多学科交叉(流行病学、生物统计学、生物信息学、分析化学等)，目前研究方向如发展更先进的分析技术(提高通量、降低样本量及费用等)、高效寻找合适的暴露标志物、混合暴露与疾病的关系、在群体水平找到与疾病相关的暴露因素、暴露组关联研究，等等。环境暴露与健康关系研究中存在一些问题，比如，针对单一环境暴露因素研究(忽略混合暴露的存在及各个暴露间的联合作用)，环境暴露因素种类局限(集中在已知的和法规重点控制的暴露)，环境暴露采样时机与疾病的自然发生进程分离(较少考虑慢性病存在潜伏期)、环境暴露采样与检测不准确，等等。对暴露内部标志物的测定要与疾病发生的“时间窗”相对应，否则，研究结果将可能因为暴露和疾病发生时间上的先后关系不清而无法得出可靠结论。.铅是环境污染中最主要和最广泛的重金属之一，由于环境污染问题的存在，普通人群均可能暴露于铅和镉。研究结果表明，铅暴露可能会改变男性的性激素，损害内分泌功能和支持细胞[7]。有研究表明：铅作为一种生殖毒物在男性接触该物质的早期就会导致直接增加附睾中雄激素结合蛋白的分泌，此种现象将会导致睾丸组织的退行性变，直接损伤间质细胞产生睾酮，促卵泡激素，促黄体生成素的能力[8]。以往的研究表明男性的铅或镉暴露均会损伤睾丸造成精子生成障碍。动物和人群研究表明：暴露于铅(pb)和镉(cd)可导致内分泌功能受到破坏，可导致性激素水平异常[4]。研究表明尿中镉浓度与与睾酮，游离睾酮及雌二醇呈现负相关关系[9]。血镉和血铅的具有协同作用，可以影响睾酮和性激素结合球蛋白的水平[4]。通常情况下，环境毒物均呈混合暴露的状态，不同化学物质间的相互作用比较复杂，根据化学物质毒性效应模式，一般有协同、加和及拮抗效应。有文献报导，铅和镉的毒性具有协同效应，铅和镉的混合暴露比铅、镉的单独暴露的危害要大[4]，但是，单独暴露均处于安全浓度的铅、镉，是否在混合暴露时能够导致性激素异常尚有待进一步研究。石墨炉原子吸收光谱法(gfaas)是目前全血中铅和镉常用的检测方法，可以做到较快速的准确定量分析[10]。然而这一方法标准工作曲线的线性范围窄，样品前处理较复杂，特别是其无法进行多元素同时分析，因此局限了其在混合暴露评估中的应用。其他常用方法诸如原子荧光光谱(afs)、电化学分析法等也具有特定的不足。电感耦合等离子体质谱(icp-ms)是用于痕量及超痕量多元素分析的质谱仪，具有灵敏度高、检出限低、选择性好、分析速度快、动态范围宽等优点，由于其多元素高通量检测的特点，因而被广泛应用于混合暴露特别是多种重金属混合暴露的检测当中[11-14]。在既往的实践中，icp-ms最初被用于环境样本如水样、土壤的重金属污染水平分析。此后又被用于具有职业暴露风险的工人体液样本中铅、镉、汞等重金属水平检测。近年来，越来越多的研究和实践中使用icp-ms作为人类各类疾病的早期标志物的识别和检测应用，如糖尿病，儿童神经发育障碍，心血管疾病，不良出生结局等，相关论文发表在学术期刊《environhealthperspect》、《epidemiology》、《environpollut》、《occupenvironmed》，体现出其在人类疾病诊断中的巨大潜力与价值。然而目前采用icp-ms分析性激素异常辅助诊断的应用还未得到相应的关注。若能发现铅、镉混合暴露作为辅助诊断标志物与性激素异常的明确关联，并研发相应疾病的icp-ms检测方法，提高检测结果的准确性与灵敏度，不仅可以在该领域获得国际领先的研究成果，还能创造可观的经济价值，并且为促进和提高我国人民生殖健康水平做出贡献。技术实现要素：本发明的目的是：1.将铅、镉混合暴露作为性激素异常辅助诊断标志物；2.建立基于icp-ms的全血中铅、镉混合暴露的检测方法；3.开发用于性激素异常辅助诊断的铅、镉混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。本发明的目的通过下列技术措施实现的：与性激素异常相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。用于检测所述暴露生物标志物的方法，该方法为采用icp-ms检测全血中的铅和镉的浓度，特别是采用内标与标准曲线混合的icp-ms检测全血中的铅和镉的浓度。所述的检测方法，该检测方法的具体步骤及参数为：a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体，使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。所述的暴露生物标志物在制备检测性激素异常的辅助诊断试剂盒中的应用。一种用于检测性激素异常的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用icp-ms检测全血中的铅和镉的浓度的试剂。所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：试剂a：稀释剂10ml(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg/l铋，其余为去离子水)；试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。(注：标准曲线采用稀释剂配置，标准曲线0浓度就是稀释剂。内标元素含量通过该元素的标准液稀释而来。)本发明详细描述如下：本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于icp-ms检测方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据纳入病例200人，根据年龄、bmi匹配对照200人，共400人。a组：健康对照组(200人，性激素水平正常)：1.年龄在22到37岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症等疾病史；b组：病例组(200人，性激素异常者)：1.年龄在25到38岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症等疾病史；二、icp-ms检测铅、镉混合暴露与性激素异常的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体，使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。3.数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑(rh)、铋(bi)分别用于校正镉和铅的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。4.数据分析：暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。5.健康对照组、病例组全血样本中铅、镉混合暴露的差异和诊断意义。经welch'st-test发现病例组铅和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著提高了性激素异常的发生风险。三、诊断试剂盒制备方法根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于性激素异常的辅助诊断试剂盒，所述辅助诊断试剂盒包含一套全血铅、镉检测的试剂及耗材。本发明的有益效果：本发明人通过采用icp-ms比较正常对照和性激素异常病例组全血中的铅、镉混合暴露水平，发现了全血中存在具有性激素异常辅助诊断价值的标志物组合，以及该标志物检测的icp-ms的应用，研制出可便于临床应用的和性激素异常辅助诊断试剂盒。本发明采用全血中铅、镉混合暴露水平作为性激素异常评价的标志物的优越性在于：(1)铅、镉混合暴露是一组新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高性激素异常辅助诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为性激素异常的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)本发明提供的铅、镉混合暴露检测可用于性激素异常的辅助诊断，可在早期通过微创方式早期诊断性激素异常，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。(3)本发明采用性激素异常病例和健康对照人群的全血样本进行验证，证明了性激素异常症病例具有较高的铅、镉暴露水平，可作为标志物使用。(4)icp-ms技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，取样后，30分钟内可出具结果，具有较高的临床诊断实用价值。(5)本发明样本操作步骤简单，且能防止样品污染，提高灵敏度，100ul全血样本加入配备好的稀释剂中即可上机进行分析，对环境及操作人员的要求降低。(6)本发明采用icp-ms技术对铅、镉联合暴露进行检测的前处理步骤进行了优化，能够更好地减少检测的成本和时间。附图说明图1健康对照组和病例组的铅暴露水平。箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。图2健康对照组和病例组的镉暴露水平，图注参考图1。图3卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了性激素异常的发生率。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1研究对象选择和分组依据本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院采集符合要求的性激素异常病例及正常对照全血样本。性激素检查正常的为对照，性激素检查异常的为病例。随机纳入100例病例，根据年龄、bmi匹配对照100人，共200人作为性激素异常铅、镉混合暴露评估的实验对象。具体的样本归类标准如下：第一阶段关联探索阶段纳入病例200人，根据年龄、bmi匹配对照200人，共400人。a组：健康对照组(200人，性激素水平正常)：1.年龄在22到37岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道等疾病史；b组：病例组(200人，性激素检查异常)：1.年龄在25到38岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道等疾病史；实施例2icp-ms检测铅、镉混合暴露与性激素异常风险的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1icp-ms优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体，使用清洗液冲洗系统。表1.2icp-ms采集参数其他步骤详见厂商说明书。进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。3.数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑、铋分别用于校正镉和铅的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。4.数据分析：暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。5.健康对照组、病例组全血样本中铅、镉混合暴露的差异和诊断意义。经welch'st-test发现病例组铅和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异(结果见图1、图2、图3)，病例组高暴露人数与对照组高暴露人数具体比例为铅高暴露2.27:1，镉高暴露：2.00:1，铅、镉均高暴露3.67:1，病例组的高暴露人数多于对照组，显著提高了性激素异常发病风险。实施例3用于检测全血铅、镉混合暴露辅助诊断性激素异常的试剂盒制作首先通过icp-ms的方法确定病例组全血中具有较高水平的铅、镉浓度，然后通过卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，铅、镉高暴露显著增加了性激素异常发病率。检测铅、镉混合暴露可以用于性激素异常的辅助诊断。此试剂盒包括一批全血中铅、镉检测用试剂和耗材，其中稀释剂用于样品稀释，其中含有稳定且可检测的内标用于实验质量控制，铅和镉标准曲线浓度梯度各一条用于绘制标准曲线进行定量分析，清洗液用于容器清晰和空白对照。此试剂盒的价值在于只需要100μl全血，即可同时检测全血中的铅、镉含量，再通过分析结果与参考值的比较用于辅助诊断性激素异常，并易于进行动态监测和观察治疗效果。具体试剂盒组成如下：试剂a：稀释剂10ml(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l铑+10μg/l铋，其余为去离子水)；试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/l；试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。主要参考文献[1]李良.男子肥胖儿少雌激素与雄激素比值升高的机制初探[d]；北京体育大学,2016.[2]高亮,刘燕,李彬,etal.帕米尔高原世居塔吉克族男性性激素水平分析[j].国际检验医学杂志,2018,5):615-7.[3]刘晓程,郭婷,李斌.早发性卵巢功能不全相关常染色体基因异常的研究进展[j].老年医学与保健,2017,6):592-6.[4]kresovichjk,argosm,turykme.associationsofleadandcadmiumwithsexhormonesinadultmales[j].environmentalresearch,2015,142(25-33.[5]nuzzir,scalabrins,beccoa,etal.gonadalhormonesandretinaldisorders:areview[j].frontiersinendocrinology,2018,9(66.[6]alii,engstroma,vahterm,etal.associationsbetweencadmiumexposureandcirculatinglevelsofsexhormonesinpostmenopausalwomen[j].environmentalresearch,2014,134(265-9.[7]鱼涛,李忠生,王笑笑,etal.男性铅作业工人生殖内分泌变化的研究[j].卫生研究,2010,4):413-5.[8]yangy,luxs,lidl,etal.effectsofenvironmentalleadpollutiononbloodleadandsexhormonelevelsamongoccupationallyexposedgroupinane-wastedismantlingarea[j].biomedicalandenvironmentalsciences:bes,2013,26(6):474-84.[9]dhoogew,denhonde,koppeng,etal.internalexposuretopollutantsandsexhormonelevelsinflemishmaleadolescentsinacross-sectionalstudy:associationsanddose-responserelationships[j].journalofexposurescience&environmentalepidemiology,2011,21(1):106-13.[10]血中镉的石墨炉原子吸收光谱测定方法[m].[11]ammannaa.speciationofheavymetalsinenvironmentalwaterbyionchromatographycoupledtoicp-ms[j].analyticalandbioanalyticalchemistry,2002,372(3):448-52.[12]tellez-plazam,guallare,howardbv,etal.cadmiumexposureandincidentcardiovasculardisease[j].epidemiology,2013,24(3):421-9.[13]vigehm,yokoyamak,seyedaghamiriz,etal.bloodleadatcurrentlyacceptablelevelsmaycausepretermlabour[j].occupationalandenvironmentalmedicine,2011,68(3):231-4.[14]ciesielskit,weuvej,bellingerdc,etal.cadmiumexposureandneurodevelopmentaloutcomesinu.s.children[j].environmentalhealthperspectives,2012,120(5):758-63.当前第1页12当前第1页12