一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种口蹄疫a型病毒siga抗体间接elisa检测试剂盒及其检测方法。本发明属于生物检测
技术领域：
。
背景技术：
：口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒引起以患病动物的口、蹄部出现水疱性疾病为特征的传染性疾病。口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)属于小rna病毒科，病毒中心是一条单链rna。根据血清型特性可分为a型、o型、c型、sat1型、sat2型、sat3型(即南非1、2、3型)和asial(亚洲1型)7个血清型，不同血清型之间几乎没有免疫保护力，感染了一种血清型fmdv的动物仍可感染另一种血清型的fmdv而发病。fmdv感染对象多达70余种，潜伏期为1～7d，传播速度快，发病急，病毒主要通过呼吸道和消化道进入动物体内，首先进入动物喉部和扁桃体，然后进入动物血液循环系统，临床症状为感染动物精神不振，唾液酸，口、蹄、鼻和乳头区域出现水泡，在fmd潜伏期，几乎所有的组织、器官、分泌物、分泌物等都含有fmdv。该疾病是国际动物卫生组织(oie)所指定的15种动物流行病名单的首位，对养殖业和国际动物贸易造成重大的经济损失。mdv基因组全长约8500个碱基，只含有一个大的开放阅读框，表达产生的聚蛋白逐级裂解产生病毒的结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4)和非结构蛋白(lab，2a、2b、2c、3a、3b、3c、3d)，结构蛋白组装产生病毒的衣壳结构，非结构蛋白则参与病毒与宿主的相互作用、抑制宿主细胞的转录翻译机制、参与病毒的复制过程。病毒衣壳蛋白是诱导产生中和抗体的主要免疫原，在结构蛋白上存在多个构象性的与线性的中和表位。fmdv的四种结构蛋白vp1、vp2、vp3、vp4中vp1的g-h环的氨基酸很容易变异，但其中的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(arg-gly-asp(rgd))高度保守。g-h环的跨度大约是vp1的140-160位的20个氨基酸残基。vp1蛋白上不仅存在主要的抗原位点(141-160aa，200-213aa和21-40aa)，而且含有fmd病毒的宿主识别位点。因此选择该区域基因构建表达载体表达纯化的蛋白可以作为良好的制备抗体检测试剂盒的备选包被抗原。另外通过原核表达系统制备的多表位抗原生产过程不涉及活病毒，不存在散毒的风险；既可随时根据流行毒株的变化调整表位序列，也可使用不同的抗原序列，增加抗原的广谱性。siga抗体作为黏膜免疫的主要效应因子，广泛存在于初乳、泪液、唾液等分泌液中，它不仅可以在第一时间中和病毒，而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应，进而阻止病毒的侵入。其主要功能有:阻抑黏附，免疫排除，溶解细菌，中和病毒，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc,antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)，抗炎症，促进天然因子作用及调节黏膜免疫反应。抗口蹄疫病毒siga抗体是口蹄疫病毒感染或者疫苗黏膜免疫后首先在呼吸道和消化道产生特异性的标志，同时也反应了黏膜免疫疫苗的效果。目前市场上还没有能够有效检测口蹄疫病毒siga抗体的试剂盒，鉴于近年来对黏膜免疫机制和黏膜免疫疫苗研究的深入，开发一种检测黏膜分泌物中口蹄疫病毒siga抗体水平的elisa试剂盒，能够更加准确地反应口蹄疫病毒感染和黏膜免疫状态，同时利用该方法监测口蹄疫病毒siga抗体动态变化规律，为口蹄疫黏膜免疫疫苗和建立配套检测方法提供了理论与实验依据。技术实现要素：本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种口蹄疫a型病毒siga抗体的检测试剂盒及其方法。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：本发明运用dnastar软件对我国分离的3株口蹄疫病毒a型代表毒株(a/gdmm/2013，a/hubwh/2009，a/gslx/62)的vp1基因进行序列分析，确定了优势抗原表位，通过在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示的间隔子序列kkk、(g4s)2和gpgpg，从而构建得到多表位基因(tb/a)的串联序列，其串联顺序为a/gdmm/2013[(20-85)-kkk-(133-172)-(g4s)2-(193-212)]-gpgpg-a/hubwh/2009[(20-85)-kkk-(133-172)-(g4s)2-(193-212)]-gpgpg-a/gslx/62[(20-85)-kkk-(133-173)-(g4s)2-(194-213)]。多表位基因的核苷酸序列委托金斯瑞生物科技公司合成。本发明得到的一种口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原，所述的口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原包含口蹄疫a型病毒代表毒株a/gdmm/2013，a/hubwh/2009，a/gslx/62的vp1蛋白中的第20-85位、第133-172位以及第193-212位的主要中和性抗原表位序列，所述的口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原的氨基酸序列如seqidno.2所示。编码所述的口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的核苷酸序列如seqidno.1所示。进一步的，本发明还提出了所述的口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原在制备检测口蹄疫a型病毒siga抗体试剂中的用途。一种口蹄疫a型病毒siga抗体elisa检测试剂盒，所述试剂盒包括口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板、100×浓缩酶标抗体、酶标抗体稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液、终止液、阳性对照样品和阴性对照样品。其中，优选的，所述口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原是经原核表达系统表达获得。其中，优选的，所述的口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板按照以下方法制备得到：(1)包被抗原的制备和包被原核表达系统表达获得的重组蛋白包涵体经复性及ni-nta纯化得到口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原，其氨基酸序列如seqidno.2所示，包被时用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/ml，按照100μl/孔包被酶标板，4℃冰箱静置过夜；(2)酶标板的封闭与保存包被过夜的酶标板用pbst洗涤4次拍干，每孔加100μl含0.5w/v％bsa的10mmpbs封闭液，37℃放置2h，弃掉封闭液，pbst洗涤3遍，得到预包被抗原的酶标板，每孔加100μl含6v/v％马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，用铝箔袋真空封口，4℃保存；其中，所述的酶标板稳定剂是将5gbsa、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/lpbs(ph7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％procline300，保存于4℃备用。其中，优选的，所述阳性对照样品是采集口蹄疫a型病毒攻毒后7-21d猪、牛以及羊的鼻拭子样品，经混合、一系列稀释后检测od450值为1.5±0.05的样品；所述阴性样品是fmdvns试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，口蹄疫a型、o型、asiai液相阻断elisa试剂盒检测血清抗体效价<1/4，fmdv特异性pcr检测抗原为阴性的猪、牛以及羊的鼻拭子，经混合、稀释后检测od450值为0.1±0.05的样品，无菌分装备用。其中，优选的，所述的100×浓缩酶标抗体为辣根过氧化物酶(hrp)标记鼠抗猪、牛或羊iga的单克隆抗体，使用时，用酶标抗体稀释液100倍稀释后使用，所述的酶标抗体稀释液是含有1v/v％甘油、0.5w/v％牛血清白蛋白、1w/v％酪蛋白以及0.05w/v％procline300的0.01mol/lpbs缓冲液，ph7.4。其中，优选的，所述的样品稀释液为含0.5mnacl、2.68mmkcl、2.79mmkh2po4、8.1mmna2hpo4、5g/l酪蛋白、0.05％tween20和10mmpbs的混合溶液；所述的显色液为tmb显色液，所述的终止液为1mol/lh2so4溶液；所述的浓缩洗涤液为10×pbst溶液，即含有0.5v/v％tween20的0.1mol/lpbs溶液，ph7.6，使用时稀释10倍。其中，优选的，利用所述的试剂盒进行口蹄疫a型病毒siga抗体检测时，按照以下步骤进行：(1)样本稀释将待测样本、阳性对照以及阴性对照用样品稀释液按体积比1：2进行稀释；(2)洗板从4℃冰箱中取出口蹄疫a型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板，打开铝箔袋，取出酶标板，以稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸拍干，每次3min；(3)加样将稀释后的待测样本、阳性对照以及阴性对照分别加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育45min；(4)洗涤取出酶标板，甩掉样品，用洗涤液漂洗4次，吸水纸拍干；(5)加入酶标抗体加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪、牛或羊iga单克隆抗体，100μl/孔，37℃工作30min；(6)加底物：甩掉酶标抗体，用洗涤液漂洗4次，吸水纸拍干，加入显色液37℃显色15min，取出后立即加入终止液；(7)结果判定在酶标仪上读取od450nm数值，待测样本的od450nm值大于等于阴性对照样品平均值的2.5倍判为阳性，小于阴性对照样品平均值的2.5倍判为阴性。本发明的技术要点为：1)以原核表达系统表达的口蹄疫a型病毒优势抗原表位蛋白(tb/a)作为包被抗原，以酶标记的鼠抗猪、牛、羊iga单克隆抗体为二抗，待检样品与包被抗原反应后，通过酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性鼻拭子和阴性鼻拭子对比，来评价口蹄疫病毒siga抗体水平。2)包被抗原是经大肠杆菌pet-30a(+))原核表达后纯化的多表位蛋白，该蛋白含有口蹄疫病毒主要抗原位点(141-160aa，200-213aa和21-40aa)，而且含有口蹄疫病毒的宿主识别位点(rgd三肽基序)。3)二抗是用辣根过氧化物酶(hrp)标记试剂盒标记的鼠抗猪、牛、羊iga单克隆抗体。4)参考阳性样品是实验室攻毒后7-21天感染口蹄疫的猪、牛、羊的鼻拭子；阴性样品是经fmdvns试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，a型、o型、asiai口蹄疫液相阻断elisa试剂盒检测抗体效价<1/4，fmdv特异性pcr检测抗原为阴性的猪、牛、羊的鼻拭子。相较于现有技术，本发明的有益效果为：1)本发明公开了一种检测口蹄疫a型病毒siga抗体的方法及其检测试剂盒，通过包被抗原、hrp标记的鼠抗猪、牛、羊iga单克隆抗体，提供了一种评价口蹄疫黏膜免疫效果的有效方法，并为口蹄疫感染的早期诊断提供了一种新方法，能够快速、准确的检测猪、牛、羊鼻拭子中的口蹄疫a型病毒siga抗体；2)由于口蹄疫病毒近些年流行毒的突变发生频率越来越高，本发明通过原核表达系统表达的3株口蹄疫a型代表毒的优势抗原表位作为包被抗原，制备出更新更全的包被抗原，提高试剂盒对现有毒株的检出能力；3)样品的采集操作简便，人力消耗小，对动物的应激小；4)该方法操作简便，所需时间短，可以用于大量样品的检测和黏膜免疫效果的评价。附图说明图1是本发明实施例提供的tb/a蛋白sds-page图；图中：泳道m1：蛋白分子量标准；泳道1：bsa蛋白；泳道2：tb/a蛋白图2是本发明实施例提供的纯化蛋白结果。图中：泳道m2：蛋白分子量标准；泳道3：洗脱蛋白。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例不会在任何方面限制本发明的保护范围。实施例1口蹄疫a型病毒siga抗体elisa检测试剂盒的制备及组装(一)试剂盒的制备：1、口蹄疫a型病毒优势抗原表位(tb/a)的筛选的设计：口蹄疫病毒结构蛋白vp1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然vp1蛋白还是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。口蹄疫病毒vp1基因全长由639个核苷酸组成，编码一条具有213个氨基酸的蛋白，其主要抗原表位集中在第140-160位的氨基酸和第200-213位的氨基酸区段。本发明用dnastar生物软件对我国分离的3株口蹄疫病毒a型代表毒株a/gdmm/2013(genbank登录号:kf450794.1)，a/hubwh/2009(genbank登录号:jf792355.1)，a/gslx/62(genbank登录号：aj131666.1)的vp1基因序列分析，确定了优势抗原表位为20-85、133-172、193-212位的氨基酸区段。为了防止在构建基因时出现新表位，在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确的间隔子序列kkk、(g4s)2和gpgpg，多表位基因的串联顺序为：a/gdmm/2013/[(20-85)-kkk-(133-172)-(g4s)2-(193-212)]-gpgpg-a/hubwh/2009/[(20-85)-kkk-(133-172)-(g4s)2-(193-212)]-gpgpg-a/gslx/62/[(20-85)-kkk-(133-173)-(g4s)2-(194-213)]多表位基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，其所编码的氨基酸序列如seqidno.2所示，多表位基因的核苷酸序列委托金斯瑞生物科技公司合成。2、口蹄疫a型病毒优势抗原表位蛋白的表达：将口蹄疫a型病毒优势抗原表位蛋白的编码基因1287bp(seqidno.1所示)克隆到pet-30a(+)原核表达载体，经酶切、测序正确后，阳性质粒转化至bl21de3plyss菌株，卡那霉素抗性tb平板筛选单克隆，37℃，tb培养基摇菌过夜；将过夜菌液按体积比(v/v)1:100转接至新鲜tb培养基，37℃，200rpm摇3h至od600值达到4左右，加入终浓度1mmol/l的iptg继续摇菌3h，6000rpm离心收集菌液。降低培养温度到30℃；加入iptg诱导剂至终浓度0.5mm，30℃继续震荡培养3-4h；8000rpm离心3min收集菌体，重悬于50ml预冷nta-0缓冲液中，冰浴30min；超声破碎菌体，16000rpm4℃离心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行sds-page检测，蛋白表达结果如图1所示。剩余上清及沉淀置于4℃备用。3、蛋白纯化、复性：沉淀以50mlnta-0缓冲液重悬，加入dtt至终浓度1mm，超声促进杂蛋白溶解，离心收集沉淀，重复三次至上清透明，沉淀以pbs重悬，超声，离心去上清，以6m盐酸胍重悬包涵体，加dtt至终浓度5mm；37℃震荡3h至包涵体全部溶解，离心去上清。再用蛋白复性液将蛋白低温透析复性，以2倍体积的3m盐酸胍稀释蛋白溶液，在4℃下逐滴加入到200ml复性液(ph8.0)中，转速调节至最大，搅拌24h，取蛋白溶液于透析袋中，以peg60000浓缩后以pbs缓冲液透析过夜。复性后的蛋白用阴离子交换柱ni-nta再次纯化，收集蛋白。蛋白纯化结果如图2所示。4、包被抗原的制备与最佳包被浓度的选择：纯化蛋白用碳酸盐缓冲液(ph9.6)系列稀释成6μg/ml，3μg/ml，1.5μg/ml，0.75μg/ml，0.38μg/ml，0.19μg/ml，每个浓度包被两列，按照100μl/孔加到96孔酶标板上，4℃包被过夜。结果表明，包被抗原浓度为3μg/ml时阳性值od450值大于1.0，且p/n的值最大，因此确定该浓度为最佳包被浓度(表1)。表1棋盘滴定抗原工作浓度(od450nm)5、标准阴、阳性鼻试子的制备：所述阳性对照样品是采集口蹄疫a型病毒攻毒后7-21d猪、牛以及羊的鼻拭子样品，经混合、一系列稀释后检测od450值为1.5±0.05的样品；所述阴性对照样品是fmdvns试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，口蹄疫a型、o型、asiai液相阻断elisa试剂盒检测血清抗体效价<1/4，fmdv特异性pcr检测抗原为阴性的猪、牛以及羊的鼻拭子，经混合、稀释后检测od450值为0.1±0.05的样品，无菌分装备用。6、最佳封闭液的确定：用不同封闭液对酶标板进行封闭，37℃封闭1h，筛选最佳封闭液，结果如表2所示。表2用不同封闭液对酶标板进行封闭(od450nm)结果表明，当选择含有0.5w/v％bsa的10mmpbs作为封闭液时阳性值od450值大于1.0，且p/n的值最大，因此确定该封闭液为最佳封闭液。7、酶标板的封闭：上述酶标板用pbst(含0.5v/v％tween20的0.01mol/lpbs溶液，ph7.6)洗4次，每孔加100μl含0.5w/v％bsa的10mmpbs封闭液，37℃放置2h。弃掉封闭液，pbst洗涤3遍，得到预包被抗原的酶标板，每孔加100μl含6v/v％马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。其中，所述的酶标板稳定剂是将5gbsa、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/lpbs(ph7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％procline300，保存于4℃备用。8、酶标抗体(10×)辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪、牛、羊iga二抗，使用时稀释10倍使用。9、样品稀释液样品稀释液为含0.5mnacl、2.68mmkcl、2.79mmkh2po4、8.1mmna2hpo4、5g/l酪蛋白、0.05％v/vtween20和10mmpbs的混合溶液。10、pbst(10×)含有0.5v/v％tween20的0.1mol/lpbs溶液，ph7.6。使用时稀释10倍使用。11、显色液以及终止液显色液为tmb显色液，终止液为1mol/lh2so4溶液。(二)试剂盒的组装及保存按照表3所列的试剂盒内容，装配试剂盒，组成后装于4℃保存。表3elisa检测试剂盒内容(三)试剂盒的使用方法(检测方法)(1)稀释：用灭菌水将pbst(10×)洗液稀释至250ml，以样品稀释液将酶标抗体(10×)稀释至5ml。(2)洗板：打开包装袋，取出预包被抗原的酶标板，以稀释好的pbst洗板4次，吸水纸拍干，每次3min。(3)加样：将样品以1：2倍稀释，每孔100ul加入到反应板中，加入阳性对照与阴性对照，100μl/孔，该阳性对照、阴性对照分别做两个重复。37℃孵育45min。(4)加酶标抗体：甩掉样品，用pbst漂洗4次，吸水纸拍干，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪、牛或羊iga二抗，100μl/孔，37℃孵育30min。(5)加底物：甩掉酶标抗体，用pbst漂洗4次，吸水纸拍干。加入tmb显色液37℃孵育15min，然后加入100μl/孔的反应终止液。(6)在酶标仪上读取od450数值。在酶标仪上读取od450数值，待测样本的od450nm值大于等于阴性对照血清平均值的2.5倍判为阳性，小于阴性对照血清平均值的2.5倍判为阴性。实施例2口蹄疫a型病毒siga抗体elisa检测试剂盒的敏感性、特异性、重复性实验1、敏感性实验：利用实施例1制备得到试剂盒检测90份鼻试子样品，这些样品是在实验攻毒后收集的鼻试子样品，在进行攻毒之前未进行任何免疫，检测方法同实施例1通过计算阳性检出率分析该方法的敏感性。elisa检测结果表明以上样品阳性88份，阴性2份，阳性检出率为97.78％。说明本发明的试剂盒具有较好的敏感性，结果如表4所示。表4elisa试剂盒敏感性试验检测方法样品数(份)阳性数(份)阴性数(份)阳性率(％)间接elisa9088297.78％2、特异性实验：利用实施例1制备得到试剂盒检测了猪流行性腹泻病毒(pedv)感染仔猪肠黏膜冲洗液样品、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)抗体阳性样品、猪圆环病毒(pcv)特异性iga抗体阳性样品、猪瘟病毒(csfv)特异性iga抗体阳性样品，针对a型、o型fmdv交叉感染情况，增加84份o型fmdv感染猪鼻拭子样品进行检测，以a型口蹄疫siga抗体阳性样品作为阳性对照，分析该方法的特异性。elisa检测结果表明84份o型fmdv感染猪鼻拭子样品阳性1份，可疑7份，阴性76份，符合率为90.5％。且与猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒(pcv)、猪瘟病毒(csfv)的iga抗体都没有交叉反应，保证了该诊断试剂盒同时具有良好的敏感性和特异性，从根本上保证了结果的准确性和可靠性。3、重复性实验：选取6份不同抗体水平的阳性鼻粘膜试子样品和1份阴性鼻粘膜试子样品，采用同一批次抗原包被elisa板，在不同时间进行4次批内重复试验，统计检测结果，批内变异系数小于7％(1.53％～6.41％)，表明同一份鼻粘膜试子样品在同一批次制备的抗原包被的elisa板内变异系数很小，具有良好的重复性。采用4个批次制备的抗原包被elisa板在同一时间进行批间重复试验，统计检测结果，批间变异系数小于8％(1.27％～7.92％)，表明同一份鼻粘膜试子样品在不同批次制备的抗原包被的elisa板内变异系数也很小，说明本发明建立的间接elisa方法具有很好的重复性(表5)。表5重复性实验结果以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国农业科学院兰州兽医研究所<120>一种口蹄疫a型病毒siga抗体elisa检测试剂盒及其应用<160>2<170>patent-in3.5<210>1<211>1287<212>dna<213>artificialsequence<400>1atgggcgagacccaggcgcagcgtcgttaccacaccgatgttggtttcctgatggaccgt60ttcgtgcagatcaagccggttggcccgacccacgtgatcgacctgatgcagacccaccaa120catggtctggttggcgcgatgctgcgtgcggcgacctactatttcagcgatctggagatt180gtggttaaccacaccggtaacaagaaaaagaccagcaaatatagcgcgccgcagaaccgt240cgtggtgacctgggtccgctggcggcgcgtctggcggcgcaactgccggcgagcttcaac300tttggcgcgatccgtgcgaccgaaatccgtggtggcggtggcagcggtggcggtggcagc360gaagtgagcagccaggatcgtcacaaacaaaagatcattgcgccggcgaagcaactgctg420ggtccgggtccgggtggtgaaacccaggttcaacgtcgtcaccacaccgacgtgagcttc480atcatggatcgttttgtgcaaattaagccggttagcccgacccatgttattgatctgatg540caaacccatcagcatggtctggttggcgctatgctgcgcgcggcgacctattacttcagc600gatctggaaatcgttgttaaccacaccggtcgtaaaaagaaaaccagcaaatatagcgct660cctgcgactcgtcgtggtgacctgggcagcctggcggcgcgcctggcggcgcagctgccg720gcgagctttaactatggtgcgatccgtgcgaccgagattcaaggtggcggtggcagcggt780ggcggtggcagcgaagtgaccagccaagaccgccataagcagaaaattatcgctcctgcg840aagcaactgctgggcccgggcccgggtggtgaaacccaagttcaacgtcgtcaacacacc900aacgtgggtttcatcatggaccgttttgttaagattccgagccagagcccgacccacgtg960atcgatctgatgcaaacccaccagcatggtctggttggcgcattattacgcgcggcgacc1020tattattttagcgacctggaaatcgtggttcgtcacgacgataacaagaaaaagaccacc1080aaatatagcaccggtaacgcgggtcgtcgtggtgatctgggcagcctggctgctcgtgtt1140gctgctcagctgccggcgagcttcaatttcggcg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