本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
1975年，e.a.carswell等人发现接种卡介苗的小鼠注射细菌脂多糖后，血清中会出现一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，并将其命名为肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)。八十年代人们发现其在消耗症中起了重要作用，又称恶液质素。tnf主要由活化的巨噬细胞，nk细胞及t淋巴细胞产生。1985年shalaby把巨噬细胞产生的tnf命名为tnf-α，把t淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin，lt)命名为tnf-β。虽然tnf-α与tnf-β仅有约30％的同源性，但它们却拥有共同的受体。tnf-α的生物学活性占tnf总活性的70％～95％，因此目前常说的tnf多指tnf-α。
tnf-α由157个氨基酸组成，是一个跨膜蛋白，它可以被tace酶切割成为可溶性的分子。血清tnf-α和il-6含量的升高与妊娠期高血压的病理生理过程密切相关。曲列尼尔能够明显降低妊娠高血压小鼠体内的tnf-α和il-6的水平，能够显著抑制低氧诱导的妊娠高血压的发病进程。因此，血清tnf-α和il-6的水平可作为一种潜在的预测标志物来用于妊娠期高血压的临床诊断与治疗。
在小儿急性肠套叠患儿中，tnf-α增高使肠道粘膜充血、水肿，持续增高可使肠道平滑肌痉挛、收缩，引起肠腔狭窄，为肠套叠的发生创造条件；同时，高浓度tnf-α可使单核细胞及血管内皮细胞等分泌较大量白介素-1(il-1)和il-6，以放大细胞因子介导的炎症作用，进一步加剧肠道粘膜的损害、加剧肠道平滑肌收缩。il-6是th2型细胞因子，在急性肠套叠患儿中，il-6升高是免疫调节作用，抗炎，抗病毒的作用，同时对抗tnf-α的作用，但tnf-α升高优势于il-6，致使肠道平滑肌持续收缩导致肠套叠的发生。急性肠套叠患儿血清中的tnf-α和il-6水平明显升高。
肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)在临床研究中发现能引起血-视网膜屏障(bloodretinalbarrier，brb)受损并协同vegf的增殖。对糖尿病微血管病变患者血清tnf-α水平的测定表明血清tnf-α浓度的增高与糖尿病性微血管病变的发生与发展有着十分密切的关系。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子的试剂盒及其检测方法。该法作为一种真正意义上的均相化学发光技术，无需载体，没有包被、洗涤过程，试剂盒组分少，且灵敏度高、重复性好、操作简单。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种肿瘤坏死因子-α的检测试剂盒，试剂盒包括：酶标记物、发光标记物、辅助剂、触发剂和校准品；其中，酶标记物的原料组分包括过氧化物酶标记的tnf-α检测抗体，发光标记物的原料组分包括9,10-二氢吖啶标记的tnf-α捕获抗体。
优选地，酶标记物的原料组分还包括0.05m磷酸盐缓冲液；更优选地，制备方法包括：称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，之后加入0.2ml新配的0.1m过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min，将上述溶液装入透析袋中，对1mmph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；加20μl0.2mph9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入1mg抗tnf-α单克隆抗体室温避光轻轻搅拌2h，加新配的4mg/ml硼氢化钠液，混匀，于4℃放置2h，将上述液装入透析袋中，对0.15mph7.4pbs透析，4℃过夜；取出透析物，加适量甘油置-20℃冰箱保存。
优选地，发光标记物的原料组分还包括0.05mtris缓冲液；更优选地，制备方法包括：发光底物acridan用500μl的dmf溶解；吸取溶解的acridan41.3μl，加入0.05m硼酸钠缓冲液708.7μl，再加入250μl抗tnf-α单克隆抗体，翻转混匀4～5次，在室温下静置30min；将标记反应管置于摇床上，在2～8℃下混合过夜，取出加入适量甘油置-20℃冰箱保存。
优选地，辅助剂的组分包括发光辅助剂和ph6.0枸橼酸盐缓冲液；更优选地，制备方法包括：称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000ml，在枸橼酸盐缓冲液中加入适量的发光辅助剂，混匀后分装，每瓶10ml置于4℃冰箱保存备用。
优选地，触发剂选用0.05mph8.0tris-hcl缓冲液；更优选地，制备方法包括：称取tris6.06g，氯化钠9g，加适量纯水溶解，再加入浓hcl2.1ml混匀。上述溶液中加入吐温-202ml混匀后定容至1000ml，混匀后分装，每瓶200ml置于4℃冰箱保存备用。
优选地，校准品包括不同浓度tnf-α抗原的校准品和0.1m磷酸盐缓冲液；更优选地，制备方法包括：配制校准品稀释液：称取磷酸二氢钾14.1g，磷酸二氢钠(2h2o)3.0g，加适量超纯水溶解，proclin-3000.5～1ml，混匀后，加超纯水定容至1000ml，即为校准品稀释液，2～8℃储存备用；配制校准品：校准品的浓度为0、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml，用校准品稀释液将纯化肿瘤坏死因子稀释至相应浓度，2～8℃储存备用。
本发明试剂盒采用双抗体夹心法检测人血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的含量。将样本、辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗tnf-α单克隆抗体、9,10-二氢吖啶(acridan)标记的抗tnf-α单克隆抗体一起反应，形成抗原抗体夹心复合物，使得辣根过氧化物酶与9,10-二氢吖啶(acridan)在空间上得以相互接近，加入发光辅助剂及触发剂，产生闪光型化学发光；而未结合的游离的hrp标记抗体和acridan标记抗体则不发光。样本中的tnf-α含量越高，测定的发光值(rlu)越大。所以，在一定浓度范围内，发光值与样本浓度成正相关，通过已知浓度的校准品及其发光值绘制工作曲线，即可根据样本的发光值计算出样本中tnf-α的含量。
第二方面，本发明提供的检测试剂盒在空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子-α中的应用。
第三方面，本发明提供的上述检测试剂盒在空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子-α时的方法，包括步骤：s1：分别加入25μl标准品、25μl过氧化物酶标记的tnf-α检测抗体和25μl发光标记物至反应管；s2：于37℃恒温箱反应15min；s3：分别加入5μl辅助剂至反应管，震荡混匀，静置1～2min；之后分别加入触发剂75μl，震荡混匀，立即检测，读取信号值；s4：对校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合，通过样本发光值计算样本浓度。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)与传统的化学发光技术需要以微孔板或磁微粒作为载体包被抗体或抗原相比，本发明提供的试剂盒和检测方法中无需载体，没有包被、洗涤过程，是一种真正意义上的均相化学发光技术。
(2)传统的酶促化学发光技术在待测分析物先后与捕获抗体和酶标记的检测抗体相结合后必须清洗2～3次，以去除未结合的或者结合不牢固的非特异性物质；而本发明是待测分析物与两个特异性抗体的结合后，通过辅助剂作用消除发光干扰，加入触发剂产生发光信号，整个过程无需洗涤。
(3)传统的酶促化学发光技术需要酶催化底物，5～10分钟左右检测发光值；而本发明是闪光型化学发光，在加入触发剂后立即产生发光信号。
(4)本发明提供的试剂盒组分少，生产过程简单，生产成本降低，易于放大生产；且检测过程便捷，易于实现全自动化。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种肿瘤坏死因子-α的检测试剂盒，试剂盒包括：酶标记物、发光标记物、辅助剂、触发剂和校准品；其中，酶标记物的组分包括过氧化物酶标记的tnf-α检测抗体和0.05m磷酸盐缓冲液；发光标记物的组分包括9,10-二氢吖啶标记的tnf-α捕获抗体和0.05mtris缓冲液；辅助剂的组分包括发光辅助剂和ph6.0枸橼酸盐缓冲液；触发剂选用0.05mph8.0tris-hcl缓冲液；校准品包括不同浓度tnf-α抗原的校准品和0.1m校准品稀释液。
一、校准品的制备
(1)配制校准品稀释液：称取磷酸二氢钾14.1g，磷酸二氢钠(2h2o)3.0g，加超纯水溶解，proclin-3000.5～1ml，混匀后，加超纯水定容至1000ml，得到校准品稀释液，2～8℃储存备用。
(2)配制校准品：校准品的浓度为0、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml，用校准品稀释液将纯化肿瘤坏死因子稀释至相应浓度，2～8℃储存备用。
二、酶标记物的制备
(1)称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2ml新配的0.1m过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min，将上述溶液装入透析袋中，对1mmph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(2)加20μl0.2mph9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入1mg抗tnf-α单克隆抗体室温避光轻轻搅拌2h，加新配的4mg/ml硼氢化钠液，混匀，于4℃放置2h，将上述液装入透析袋中，对0.15mph7.4pbs透析，4℃过夜。
(3)取出透析物，加适量甘油置-20℃冰箱保存。
三、发光标记物的制备
(1)将发光底物acridan用500μl的dmf溶解。
(2)吸取溶解的acridan41.3μl，加入0.05m硼酸钠缓冲液708.7μl，再加入250μl抗tnf-α单克隆抗体，翻转混匀4～5次，在室温下静置30min。
(3)将标记反应管置于摇床上，在2～8℃下混合过夜，取出加入适量甘油置-20℃冰箱保存。
四、辅助剂的制备
称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000ml，在枸橼酸盐缓冲液中加入发光辅助剂，混匀后分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装10ml。
五、触发剂的制备
称取tris6.06g，氯化钠9g，加适量纯水溶解，再加入浓hcl2.1ml混匀；之后加入吐温-202ml，混匀后定容至1000ml，分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装200ml。
本发明还提供了一种采用肿瘤坏死因子-α检测试剂盒在空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子-α时的方法，包括步骤：
s1：分别加入25μl标准品、25μl过氧化物酶标记的tnf-α检测抗体和25μl发光标记物至化学发光反应管。
s2：于37℃恒温箱反应15min。
s3：分别加入5μl辅助剂至化学发光反应管，震荡混匀，静置1～2min；之后分别加入触发剂75μl，震荡混匀，立即检测，读取信号值。
s4：对校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合，通过样本发光值计算样本浓度。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例一
本实施例提供一种肿瘤坏死因子-α的检测试剂盒，包括：酶标记物、发光标记物、辅助剂、触发剂和校准品；其中，校准品包括不少于6个不同浓度tnf-α抗原的校准品和0.1m磷酸盐缓冲液；酶标记物包括过氧化物酶标记的tnf-α检测抗体和0.05m磷酸盐缓冲液；发光标记物包括9,10-二氢吖啶标记的tnf-α捕获抗体和0.05mtris缓冲液；辅助剂的组分包括发光辅助剂和ph6.0枸橼酸盐缓冲液；触发剂选用0.05mph8.0tris-hcl缓冲液。
一、校准品的制备
(1)配制校准品稀释液：称取磷酸二氢钾14.1g，磷酸二氢钠(2h2o)3.0g，加超纯水溶解，proclin-3000.8ml，混匀后，加超纯水定容至1000ml，得到校准品稀释液，4℃储存备用。
(2)配制校准品：校准品的浓度为0、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml，用校准品稀释液将纯化肿瘤坏死因子稀释至相应浓度，4℃储存备用。
二、酶标记物的制备
(1)称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2ml新配的0.1m过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min，将上述溶液装入透析袋中，对1mmph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(2)加20μl0.2mph9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入1mg抗tnf-α单克隆抗体室温避光轻轻搅拌2h，加新配的4mg/ml硼氢化钠液，混匀，于4℃放置2h，将上述液装入透析袋中，对0.15mph7.4pbs透析，4℃过夜；
(3)取出透析物，加适量甘油置-20℃冰箱保存。
三、发光标记物的制备
(1)将发光底物acridan用500μl的dmf溶解；
(2)吸取溶解的acridan41.3μl，加入0.05m硼酸钠缓冲液708.7μl，再加入250μl抗tnf-α单克隆抗体，翻转混匀5次，在室温下静置30min；
(3)将标记反应管置于摇床上，在4℃下混合过夜，取出加入适量甘油置-20℃冰箱保存。
四、辅助剂的制备
称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000ml，在枸橼酸盐缓冲液中加入发光辅助剂，混匀后分装，每瓶10ml置于4℃冰箱保存备用。
五、触发剂的制备
称取tris6.06g，氯化钠9g，加适量纯水溶解，再加入浓hcl2.1ml混匀；之后加入吐温-202ml，混匀后定容至1000ml，分装，每瓶200ml置于4℃冰箱保存备用。
实施例二
本实施例提供一种采用肿瘤坏死因子-α检测试剂盒在空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子-α时的方法，包括步骤：
s1：分别加入25μl标准品、25μl过氧化物酶标记的tnf-α检测抗体和25μl发光标记物至化学发光反应管。
s2：于37℃恒温箱反应15min。
s3：分别加入5μl辅助剂至化学发光反应管，震荡混匀，静置1～2min；之后分别加入触发剂75μl，震荡混匀，立即检测，读取信号值。
s4：对校准品的浓度和发光值进行logistic四参数拟合，通过样本发光值计算样本浓度。
本发明采用空间邻近化学发光法检测肿瘤坏死因子，灵敏度可达到5pg/ml。对于败血症和重度感染病人，血清中肿瘤坏死因子的含量与预后密切相关，血清中肿瘤坏死因子的含量高，则预后差。
当然，除了实施例一和实施例二列举的情况，制备过程中的其他条件和参数等也是可以的。
申请人经过创造性劳动后发现：本发明提供的检测方法作为一种真正意义上的均相化学发光技术，无需载体，没有包被、洗涤过程，试剂盒组分少，且灵敏度高、重复性好、操作简单。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。