一种高通量检测油脂中磷脂含量的方法与流程

本发明涉及一种高通量检测油脂中磷脂含量的方法，属于生物化学分析检测领域。

背景技术

油脂主要由甘油三酯组成，是人们食物的重要组成部分，其不仅能改善食物口感、风味，还能为人体提供热量及营养素。原料不同，油脂中磷脂含量有较大差别，磷脂组分在很大程度上影响油脂的营养价值，同时也对油的品质造成一定的影响。有研究表明，油脂中磷脂品质会影响油品的色泽及风味，且能促进油脂发生光氧化，继而影响油的储藏特性。因此，对油脂中磷脂组分的检测分离对于揭示其在油脂品质变化中的作用机理，在加工及储藏过程中对油品进行精准控制具有重要意义。

磷脂组分种类、结构繁杂，其分析手段也经历了从薄层色谱到高效液相色谱直至液相色谱质谱联用的发展阶段，由于技术水平等因素的限制，截至目前，油脂中磷脂组分的检测多数还停留在相对定量的阶段，因此无法准确得知油脂中磷脂的具体含量。

技术实现要素：

为解决现有技术的局限，本发明提供一种高通量检测油脂中磷脂含量的方法，该检测方法高效、精准。

技术方案

本发明采用超高效液相(uplc)分离、串联飞行时间质谱(triple-tof-ms/ms)同时测定油脂中磷脂组分的含量。其中，超高效液相色谱以含甲酸的甲醇-水溶液为流动相，ab6600tripletof质谱仪能够在控制软件(analysttf1.7,absciex)控制下基于ida功能进行一级、二级质谱数据采集，结合内标法，对磷脂组分进行定性和定量分析。具体方案如下：

一种高通量检测油脂中磷脂含量的方法，包括如下步骤：

(1)制备油脂样品待测液

取10μl油脂样品，加入到390μl水中，然后加入9μl混合内标溶液和951μl提取液，然后涡旋震荡，超声提取后离心，取上清液，将上清液旋干，然后加入100μl复溶液复溶，得到油脂样品待测液；

所述混合内标溶液由10ppm的d15:0/18:1磷脂酰乙醇胺内标液、10ppmd18:1溶血性磷脂酰胆碱内标液和100ppm的d15:0/18:1/15:0甘油三酯的甲基叔丁基醚/甲醇内标液组成；

所述提取液为体积比为5:1的甲基叔丁基醚/甲醇溶液；

(2)检测

采用uplc-triple-tof-ms/ms测定待测样品，通过对比样品中保留时间/一级质谱和二级质谱信息，确定样品中是否含有目标磷脂成分，然后按峰面积归一化法求得各成分的相对质量百分含量；

uplc检测在超高效液相色谱仪上进行，进样量为6μl，流动相包括a相和b相，其中a相为乙酸铵在水/乙腈混合溶剂中形成的混合溶液，乙酸铵在混合溶液里的浓度为10mm；b相为乙酸铵在乙腈/异丙醇混合溶剂中形成的混合溶液，乙酸铵在混合溶液里的浓度为10mm；流动相的流速为0.3ml/min，柱温为50℃；

ms/ms检测在质谱仪上进行，正离子检测质谱条件：离子源喷雾电压为5500v，离子源温度为550℃，解簇电压为100v，离子源气体1和2的气压均为60psi，气帘气压强为30psi，扫描范围为200～1000u；负离子检测质谱条件：离子源喷雾电压为-4500v，离子源温度为400℃，解簇电压为100v，离子源气体1和2的气压均为60psi，气帘气压强为35psi，扫描范围为500～1000u。

进一步，步骤(1)中，所述混合内标溶液中，10ppm的d15:0/18:1磷脂酰乙醇胺内标液、10ppm的d18:1溶血性磷脂酰胆碱内标液和100ppm的d15:0/18:1/15:0甘油三酯的甲基叔丁基醚/甲醇内标液的体积比为1:1:1。

进一步，步骤(1)中，涡旋震荡时间为60s。

进一步，步骤(1)中，离心转速为3000rpm，离心时间为15-20min。

进一步，步骤(1)中，所述复溶液为体积比1：1的二氯甲烷/甲醇混合液。

进一步，步骤(2)中，水/乙腈混合溶剂中，水/乙腈的体积比为2:3。

进一步，步骤(2)中，乙腈/异丙醇混合溶剂中，乙腈/异丙醇的体积比为1:9。

进一步，步骤(2)中，uplc过程中，梯度洗脱程序为：0.01min时，a相/b相的体积比为60/40，逐渐改变梯度到12min，变成0/100，并维持到13.5min，进一步改变梯度到13.7min变成60/40，并维持到18.0min。

本发明的有益效果是：本发明将待测油脂样本预处理后，再进行提取，然后进行超高效液相色谱-质谱检测。该方法操作简便、准确度高、选择性好，能快速检测油脂中的磷脂组分并进行定性和定量，检测灵敏度高。

附图说明

图1为实施例1中菜籽油样品磷脂检测正离子模式tic色谱图；

图2为实施例1中菜籽油样品磷脂检测负离子模式tic色谱图；

图3为实施例1中qc检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，uplc检测所用的超高效液相色谱仪型号为1290uplc，agilent，色谱柱为kinetexc18(2.1×100mm，1.7μm；美国phenomen公司)；ms/ms检测所用质谱仪为ab6600tripletof质谱仪，但并不限如此。

实施例1

检测菜籽油样本中磷脂组分

一种高通量检测油脂中磷脂含量的方法，包括如下步骤：

(1)制备油脂样品待测液

取10μl菜籽油样品，加入到390μl水中，然后加入9μl混合内标溶液和951μl提取液，然后涡旋震荡60s，超声提取10min后离心(离心转速为3000rpm，离心时间为15min)，取上清液，重复3次，将上清液合并后旋干，然后加入100μl复溶液复溶，得到油脂样品待测液；

所述混合内标溶液由3μl10ppm的d15:0/18:1磷脂酰乙醇胺内标液、3μl10ppmd18:1溶血性磷脂酰胆碱内标液和3μl100ppm的d15:0/18:1/15:0甘油三酯的甲基叔丁基醚/甲醇内标液组成；

所述提取液为体积比为5:1的甲基叔丁基醚/甲醇溶液；

所述复溶液为体积比1：1的二氯甲烷/甲醇混合液。

(2)检测

采用uplc-triple-tof-ms/ms测定待测样品，通过对比样品中保留时间/一级质谱和二级质谱信息，确定样品中是否含有目标磷脂成分，然后按峰面积归一化法求得各成分的相对质量百分含量；每隔5个样品做一次质控(qc)以保证检测准确度；

uplc测试在超高效液相色谱仪上进行，进样量为6μl，流动相包括a相和b相，其中a相为乙酸铵在水/乙腈(2:3，v/v)混合溶剂中形成的混合溶液，乙酸铵在混合溶液里的浓度为10mm；b相为乙酸铵在乙腈/异丙醇(1:9，v/v)混合溶剂中形成的混合溶液，乙酸铵在混合溶液里的浓度为10mm；流动相的流速为0.3ml/min，柱温为50℃；

uplc过程中，梯度洗脱程序为：0.01min时，a相/b相的体积比为60/40，逐渐改变梯度到12min，变成0/100，并维持到13.5min，进一步改变梯度到13.7min变成60/40，并维持到18.0min；

ms/ms测试在质谱仪上进行，正离子检测质谱条件：离子源喷雾电压(is)为5500v，离子源温度(tem)为550℃，解簇电压(dp)为100v，离子源气体1和2的气压均为60psi，气帘气压强为30psi，扫描范围为200～1000u。

负离子检测质谱条件：离子源喷雾电压(is)为-4500v，离子源温度(tem)为400℃，解簇电压(dp)为100v，离子源气体1和2的气压均为60psi，气帘气压强为35psi，扫描范围为500～1000u。

图1为实施例1中菜籽油样品磷脂检测正离子模式tic色谱图；图2为实施例1中菜籽油样品磷脂检测负离子模式tic色谱图。

使用proteowizard软件将质谱原始转成mzxml各式，再使用xcms做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，minfrac设为0.5，cutoff设为0.6，使用本实验室基于xcms软件、自撰写r程序包及自建磷脂二级数据库进行磷脂鉴定，再根据加入的is浓度及其峰面积、各磷脂物质峰面积以及rf数据代入相应的公式计算出样本中磷脂物质绝对含量。

经检测，菜籽油中共测出32种磷脂，其中磷脂酰胆碱4个，磷脂酰乙醇胺(pe)14个，磷脂酸11个，磷脂酰甘油3个。

qc检测结果见图3，由图3可以看出，三组质控的峰基本重合，说明该方法下仪器检测结果很稳定，保证了实验的准确度。