一种基于代谢组学鉴别广陈皮与陈皮品种的方法与流程

本发明涉及中药材分析检测领域，具体涉及一种基于代谢组学鉴别广陈皮与陈皮品种的方法。

背景技术：

《中华人民共和国药典》(2015版)记载，陈皮药材可分为“陈皮”及“广陈皮”，将陈皮与广陈皮放在了并列的位置，其中广陈皮来源于广东新会的茶枝柑的干燥成熟果皮，主产于广东新会，故又名新会陈皮，为公认的陈皮道地药材，具有芳香行气、健胃、燥湿化痰的功效。自古以来，其良好的药效己经得到了广泛认可，且位列十大广药之一，有“南方人参”、“一片值千金”之说，并“陈久者良”。由此可见，广陈皮具有很高的药用价值，价格也较昂贵，特别是储存年限较长的广陈皮。因此市场上不乏商家以普通陈皮代替广陈皮赚取更高的利润。

随着现代药理学和医学的发展，广陈皮的质量控制体系研究尤为迫切。目前对陈皮的质量评价主要是着重于检测其中一个或几个化合物含量为指标判定药材质量的结论过于局限，无法全面地评价药材质量。中国药典通过性状鉴别区分广陈皮与陈皮，以橙皮苷含量作为质量控制的指标。虽然常规性状显微鉴别可以达到一定的效果，但是难免存在一定的主观性和经验依赖性。因此，急需一种快速、有效的分析方法，用于陈皮品种的鉴别及质量评价。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于在提供一种鉴别广陈皮与陈皮品种的方法。

本发明的另一目的在于在提供一种鉴别广陈皮与陈皮品种的标志代谢物。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于代谢组学鉴别广陈皮与陈皮品种的方法，包括以下步骤：

(1)陈皮样品的制备；

(2)陈皮样品的检测；

(3)陈皮样品化学成分的鉴定；

(4)代谢组学数据的处理与分析。

进一步的，陈皮样品的制备步骤为：将样品粉碎得样品粉末，每0.08～0.121g样品粉末用甲醇溶液定容至5ml，超声处理，再用甲醇溶液补足减失的重量，混匀，离心取上清，即得。

进一步的，所述甲醇溶液的体积浓度为45～55％v/v。

进一步的，超声处理的条件为320～370w，32～37khz。

进一步的，超声处理的时间为50～70min。

进一步的，所述陈皮样品的检测为色谱-质谱检测；

其中色谱条件为：流动相为水-乙腈，梯度洗脱的程序为0～2min，0～10％乙腈；2～5min，10％～35％乙腈；5～18min，35％～90％乙腈；18～20min，90％～10％乙腈；20～22min，10％乙腈；流速0.18～0.22ml/min；柱温38～42℃；进样体积为2.8～3.2μl；

质谱条件为：正离子模式检测；雾化气体为n2，碰撞气体为氦；扫描范围为m/z50～1000。

进一步的，陈皮样品化学成分的鉴定包括已知化学成分和未知化学成分的鉴定，对于已知化学成分，采用unifi数据库，根据化合物的名称、分子式、结构式信息进行鉴定，对于未知化合物，根据精确的分子量、质谱碎片和色谱保留时间，应用在线生物数据库进行结构表征。

进一步的，代谢组学数据的处理与分析包括：将步骤(2)获得的广陈皮和陈皮的检测数据采用markerlynx4.1软件进行数据预处理，获得代谢物的保留时间和峰面积数据文件，处理后数据导入simca-p14.0软件进行多元统计分析；

所述多元统计分析的具体内容为：选取pca和opls-da模型进行主成分和差异性代谢物的筛选，基于步骤(3)鉴定的化学成分，获得能够区分广陈皮和陈皮的19个标志代谢物：芦荟松、维采宁-2、橙皮素查尔酮、枳属苷、异柚皮苷、5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、3'-羟基-4',5,6,7,8-五甲氧基黄酮、芹菜素、橙皮素、2',3',4',5,7-五甲基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮、3',4',5,7-四甲基二氢槲皮素、5,7,3',4'-四甲氧基黄酮、苯甲醇-β-d-吡喃葡萄糖苷、5,7,8,4'－四甲氧基黄酮、圣草酚、4'-羟基-5,6,7,8-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,3',4'-六甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-3,6,7,8,3'-五甲氧基黄酮。

进一步的，代谢组学数据的处理与分析还包括：将19个标志代谢物信息导入metaboanalyst4.0软件，生成heatmap图，显示广陈皮和陈皮中的标志代谢物的变化，使数据可视化；广陈皮样品中4个标志代谢物(5,7,3',4'-四甲氧基黄酮、4'-羟基-5,6,7,8-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,3',4'-六甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-3,6,7,8,3'-五甲氧基黄酮)低于平均水平，其余15个标志代谢物(芦荟松、维采宁-2、橙皮素查尔酮、枳属苷、异柚皮苷、5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、3'-羟基-4',5,6,7,8-五甲氧基黄酮、芹菜素、橙皮素、2',3',4',5,7-五甲基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮、3',4',5,7-四甲基二氢槲皮素、苯甲醇-β-d-吡喃葡萄糖苷、5,7,8,4'－四甲氧基黄酮、圣草酚)均高于平均水平；反之则为陈皮样品。

本发明的有益效果是：

本发明用于鉴别广陈皮与陈皮品种的标志代谢物能够清晰地揭示广陈皮和陈皮的差异，具有很好的区分广陈皮和陈皮的效果，为陈皮品种的鉴定和质量评价提供了一种优良的方法。

附图说明

图1是陈皮和广陈皮样品代表性基峰强度(bpi)的色谱图，图中横坐标时间单位为min。

图2是广陈皮和陈皮pca得分图，其中(gcp)表示广陈皮，(cp)表示陈皮。

图3是广陈皮和陈皮opls-da得分图(a)、置换检验图(b)和s-plot图(c)，其中(gcp)表示广陈皮，(cp)表示陈皮。

图4是广陈皮和陈皮heatmap图，其中(gcp)表示广陈皮，(cp)表示陈皮。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1基于代谢组学鉴别鉴别广陈皮与陈皮品种

1.仪器与试药

1.1仪器：watersacquityuplc^tm-xevog2qtof超高效液相-质谱联用仪

1.2试药：广陈皮收集于广东省江门市新会区，陈皮收集于医院和药店，甲醇、乙腈为色谱级，甲酸为分析纯。

2.广陈皮和陈皮样品的制备

取广陈皮和陈皮作为实验材料，采用粉碎机将陈皮样品粉碎至粉末状，取陈皮粉末0.1g，精密称定，置5ml容量瓶中，加50％甲醇5ml，称量，静置60min，超声(350w，35khz)提取60min，放冷，再称量，用50％甲醇补足减失的量，摇匀，离心(13000转)10min，取上澄清液，即得。

3.广陈皮和陈皮样品成分的lc-ms检测

色谱条件：acquityuplc^○rbehc18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；流动相：水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱(0～2min，0～10％b；2～5min，10％～35％b；5～18min，35％～90％b；18～20min，90％～10％b；20～22min，10％b)；流速0.2ml/min；柱温40℃；进样体积为3μl。

质谱条件：正离子模式检测。雾化气体为高纯度氮气(n2)，碰撞气体为超高纯氦气(he)。扫描方式：scan；扫描范围:m/z50～1000；lockmass:亮氨酸脑啡肽，m/z为556.2771。

根据上述条件对广陈皮和陈皮样品进行检测，得到广陈皮和陈皮的bpi图(图1)。

4.广陈皮和陈皮样品化学成分的鉴定

将上述获得的lc-ms(液相色谱-质谱)检测数据进行分析、结构表征、鉴定等，结果发现，从广陈皮样品中检测出86种化学成分，从陈皮中检测出83种化学成分，具体见表1。

表1广陈皮和陈皮样品中鉴定的化学成分

“+”表示已检出，“-”未检出，“gcp”代表广陈皮，“cp”代表陈皮

5.鉴别广陈皮与陈皮品种标志代谢物的获得

再将步骤3中lc-ms检测的原始数据采用markerlynx4.1软件进行预处理，包括峰识别、峰对齐、峰匹配、归一化等，得到物质的保留时间和峰面积数据文件。将预处理后的数据导入simca-p14.0软件进行多元统计数据分析，首先进行无监督的pca分析，观察广陈皮和陈皮的区分情况，再通过opls-da分析，筛选差异性代谢物(vip>1.2且p<0.05)。结合上步鉴定得到的化学成分(见表1)，即得到用于鉴定广陈皮和陈皮的标志代谢物。由pca和opls-da得分图(图2和图3a)可知，广陈皮与陈皮样本群在图中处于不同的空间聚落，区分效果明显。说明这两者在代谢产物上存在明显的差异。置换检验分析显示，r2和q2截距分别为0.999和0.945，从而证明pls-da模型是可靠的(图3b)。从s-plot远离原点的两端筛选出vip>1的代谢物(图3c)，结合步骤4鉴定得到的化学成分，并进行统计学t检验，其中有统计学差异(p<0.05)的有19个化合物，即可作为鉴定广陈皮和陈皮的标志代谢物，具体见表2。

表2广陈皮和陈皮的标志代谢物

将获得的广陈皮和陈皮的标志代谢物及其保留时间和峰面积导入metaboanalyst4.0软件，生成heatmap图，可以直观的看出广陈皮和陈皮样品中标志代谢物的变化趋势(图4)。样品明确分为两大类：广陈皮样品和陈皮样品，与图2中的pca结果一致。颜色表示每种标志代谢物的信号强度：红色框表示代谢物的信号强度大于样品中的平均水平，蓝色框表示代谢物强度小于平均水平。在广陈皮中标志代谢物5,7,3',4'-四甲氧基黄酮、4'-羟基-5,6,7,8-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,3',4'-六甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-3,6,7,8,3'-五甲氧基黄酮小于平均水平，其余15个代谢物(芦荟松、维采宁-2、橙皮素查尔酮、枳属苷、异柚皮苷、5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、3'-羟基-4',5,6,7,8-五甲氧基黄酮、芹菜素、橙皮素、2',3',4',5,7-五甲基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮、3',4',5,7-四甲基二氢槲皮素、苯甲醇-β-d-吡喃葡萄糖苷、5,7,8,4'－四甲氧基黄酮、圣草酚)均大于平均水平。陈皮反之，显然，大部分标志代谢物在广陈皮样品中的水平高于陈皮。

实施例2一种鉴别广陈皮与陈皮品种的方法

1)供试品溶液的制备

取10批(广陈皮、陈皮各5批)作为盲样本，采用粉碎机将其粉碎至粉末状，取该粉末0.1g，精密称定，置5ml容量瓶中，加50％甲醇5ml，称量，静置60min，超声(350w，35khz)提取60min，放冷，再称量，用50％甲醇补足减失的量，摇匀，离心(13000转)10min，取上澄清液，即得。

2)lc-ms检测

色谱条件：acquitybehc18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；流动相：水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱(0～2min，0～10％b；2～5min，10％～35％b；5～18min，35％～90％b；18～20min，90％～10％b；20～22min，10％b)；流速0.2ml/min；柱温40℃；进样体积为3μl。

质谱条件：正离子模式检测。雾化气体为高纯度氮气(n2)，碰撞气体为超高纯氦气(he)。扫描方式：scan；扫描范围:m/z50～1000；lockmass:亮氨酸脑啡肽，m/z为556.2771。

3)据lc-ms检测结果判定样品品种

第一步：将上述获得的10个测试样本的lc-ms检测数据，采用markerlynx4.1软件进行预处理，包括峰识别、峰对齐、峰匹配、归一化等，得到物质的保留时间和峰面积数据文件。使用实施例1步骤5中的opls-da模型。结果显示：在opls-da得分图中10批测试样本分别正确落在广陈皮、陈皮的品种区域内。该模型能够正确鉴别测试样本的品种。

第二步：将获得的10个测试样本的标志物代谢物及其保留时间和峰面积导入metaboanalyst4.0软件，生成heatmap图，可以直观的看出测试样本中标志物代谢物的变化趋势。结果显示：所有盲样本正确放置在预测的品种区域内。19个标志代谢物中4个(5,7,3',4'-四甲氧基黄酮、4'-羟基-5,6,7,8-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,3',4'-六甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-3,6,7,8,3'-五甲氧基黄酮)低于平均水平，其余15个标志代谢物(芦荟松、维采宁-2、橙皮素查尔酮、枳属苷、异柚皮苷、5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、3'-羟基-4',5,6,7,8-五甲氧基黄酮、芹菜素、橙皮素、2',3',4',5,7-五甲基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮、3',4',5,7-四甲基二氢槲皮素、苯甲醇-β-d-吡喃葡萄糖苷、5,7,8,4'－四甲氧基黄酮、圣草酚)高于平均水平，则该样品为广陈皮样品，反之为陈皮样品。使用这两个简单步骤以及pls-da模型，可以区分陈皮及广陈皮。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。