一种测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法与流程

本发明属于烟草烟气暴露生物标记物检测领域，具体涉及一种测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法。

背景技术：

吸烟与健康是当前公共卫生界最受关注的研究热点之一，如何准确测定与人体健康相关的标志物则是研究的关键。根据文献报道：卷烟燃烧后会生成丙烯醛、苯、1,3-丁二烯、氰化氢、苯乙烯、巴豆醛等挥发性有害成分，这些成分被人体吸入后会对代谢过程产生影响。由于尿液中的巯基尿酸本底值较低，又能较为准确的反映出外源性化合物的特性，因此常常被作为生物监测指标应用于遗传毒物的生物监测。有研究表明巯基尿酸与人体每日吸烟量具有较强的相关性，可以用于评价卷烟烟气中丙烯醛、苯、1,3-丁二烯、氰化氢、苯乙烯、巴豆醛等的接触水平；其中，相关性最强的巯基尿酸有4种，分别是：n-乙酰基-s-(3,4-二羟基丁基)-l-半胱氨酸(dhbma)、n-乙酰基-s-(3-羟基丙基)半胱氨酸(3-hpma)、n-乙酰基-s-(2-氰乙基)-l-2-氨基-3-巯基羧酸(cema)和苯巯基尿酸(spma)。因此，准确测定人体尿液中巯基尿酸的含量对研究吸烟与健康的相关性具有重要的科学意义。

目前，关于尿液中巯基尿酸的定量分析方法较为复杂，最常用的是hplc法和hplc-ms/ms法。hplc-ms/ms法与传统检测方法相比，具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、检测范围广等优点，在人体代谢产物分析中已经得到了广泛应用。但是，目前文献报道的hplc-ms/ms测定巯基尿酸的方法大多前处理操作复杂繁琐，样品需超低温冰箱冷冻，解冻后再经固相萃取净化、离心分离蛋白、过滤等步骤，整个过程耗时较长。

因此寻找一种有效、可靠、方便的方法以此来测定烟草暴露后人体尿液中4种巯基尿酸的含量，以此来评估烟气中相关物质的暴露水平，是十分必要和意义重大的。

技术实现要素：

本发明提供一种测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，其有效解决了现有的尿液中巯基尿酸的测试方法前处理操作复杂繁琐、尿液不稳定、耗时长的问题。

一种测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立：配制标准工作液和内标工作液，并以实际尿液样品为基质进行混合标准溶液的配制，利用uplc-ms/ms分析并建立标准工作曲线；

(2)收集尿液样品，样品前处理，利用甲醇调节尿液的稳定性；

(3)将步骤(2)制备的尿液样品过滤，利用uplc-ms/ms对尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中4种巯基尿酸含量。

上述测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，步骤(1)包括如下具体步骤：

a、标准工作液的配制：准确称取cema、3-hpma、spma、dhbma标准品各0.1g于100ml的4个容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/ml的混合标准溶液；使用时用甲醇稀释成5.0μg/ml的标准工作液；

b、内标工作液的配制：准确称取d³-cema、d⁷-dhbma、d³-3-hpma和d⁵-spma标准品各0.1g于100ml的4个容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/ml的混合内标储备液；使用时用甲醇稀释成2.5μg/ml的内标工作液；

c、标准工作曲线的绘制：分别取7份尿液平行样品于7个容量瓶中，每份1.0ml，分别加入1.0ml的内标工作液和3.0ml的水，然后再分别加入0.0ml、0.01ml、0.025ml、0.1ml、0.25ml、1.0ml、4.0ml的标准工作液，用甲醇定容到刻度，其中尿液样品中甲醇的体积浓度为60％，摇匀、过滤，利用uplc-ms/ms测定分析并建立标准工作曲线。

上述测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，步骤(2)中尿液样品的前处理包括：采集吸烟者尿液样品后，及时准确移取1.0ml的样品于自制的样品前处理萃取瓶中，加入1.0ml的内标工作液，3.0ml的水，再用甲醇定容到10ml。

上述测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，步骤(2)中尿液样品中甲醇的体积浓度为30～95％。

上述测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，步骤(3)中uplc-ms/ms的条件为：

液相色谱条件：watersacquityuplctmbehc18(2.1×50mm,1.7μm)色谱柱，流速0.5ml/min，柱温30℃，进样量5.0μl，流动相a为0.05％的乙酸水溶液，b为甲醇，按0.0min(90％a)、1.0min(70％a)、3.0min(20％a)、5.0min(20％a)、6.0min(90％a)、8.0min(90％a)进行梯度洗脱；

质谱条件：电离源为电喷雾离子源，采用负离子扫描方式，喷雾电压(is)为：-4400v，离子源温度(tem)为：500℃，雾化气(gas1)压力为：50psi，进口电压(ep)为：-10v，气帘气压力(cur)为：30psi，出口电压(cxp)为：-10v，辅助雾化气(gas2)压力为：45psi，驻留时间为：100ms。

上述测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，步骤(3)中过滤膜的孔径为0.45μm。

本发明中自制的样品前处理萃取瓶的结构示意图如图2所示，其包括瓶身1和瓶盖3，瓶身1内容纳有可沿瓶身1轴向移动的下压套管2，下压套管2与瓶身1的瓶底相靠近的一端间隔设有第一过滤膜4和第二过滤膜6，下压套管2远离瓶底的一端设有瓶盖3，瓶盖3与瓶身1螺纹连接。

本发明优选的实施方案中，第一过滤膜4和第二过滤膜6上放置有填料，填料为干燥剂颗粒、碳吸附颗粒、或硅胶颗粒中的一种或多种。

本发明优选的实施方案中，第一过滤膜4和第二过滤膜6的孔径为0.45μm。

本发明优选的实施方案中，瓶盖3内设有橡胶垫5，橡胶垫5可密封也可开口，取决于进样需求。

本发明中自制的样品前处理萃取瓶的使用过程如下：将待测样品称量后放置于瓶身1中，并添加提取溶剂，然后根据样品前处理需求，在第一过滤膜4和/或第二过滤膜6上放置填料(填料为干燥剂颗粒、碳吸附颗粒、或硅胶颗粒中的一种或多种)，然后利用超声、振荡或加热等方式进行提取处理，提取结束后，打开瓶盖3，将下压套管2压入瓶身2中，使得第一过滤膜4和/或第二过滤膜6浸没在瓶身2的提取溶剂中，从而对测试样品进行过滤和转移，从而完成测试样品的提取、干燥、过滤和转移的一体化操作处理，最后可将待测试样品直接放置到分析仪器上进行检测分析。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明无需像常规色谱分析中利用固相萃取净化来消除基质效应的干扰，而是采用以实际尿液样品为基质进行标准曲线的绘制，在标准工作曲线的绘制过程中保持了标准曲线的基质和实际样品基质完全一致，有效避免了尿液基质的干扰，该测试方法稳定性好、准确度高。

(2)本发明意外发现在尿液中添加甲醇可以调节尿液的稳定性，当尿液样品中甲醇的体积浓度大于50％后，样品中的四种巯基尿酸均可保持稳定，在1周内降解率不超过5％。

(3)本发明意外发现在尿液中添加甲醇可以调节尿液的稳定性，无需将尿液样品进行冷冻保存、离心分离等复杂的前处理过程，而是采用本发明自制的样品前处理萃取瓶对尿液直接进行萃取、干燥和过滤分离的一体化操作，利用本发明自制的样品前处理萃取瓶大大简化了尿液样品的前处理操作，有效提高了实验效率。

附图说明

图1为4种巯基尿酸及相应氘代内标的质谱图；

图2为本发明中自制的样品前处理萃取瓶的结构示意图；

其中，附图标记含义如下：

1-瓶身，2-下压套管，3-瓶盖，4-第一过滤膜，5-橡胶垫，6-第二过滤膜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

一种测定吸烟者尿液中4种巯基尿酸的方法，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立，包括如下步骤：

a、标准工作液的配制：准确称取cema、3-hpma、spma、dhbma标准品各0.1g于100ml的4个容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/ml的混合标准溶液；使用时用甲醇稀释成5.0μg/ml的标准工作液；

b、内标工作液的配制：准确称取d³-cema、d⁷-dhbma、d³-3-hpma和d⁵-spma标准品各0.1g于100ml的4个容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/ml的混合内标储备液；使用时用甲醇稀释成2.5μg/ml的内标工作液；

c、标准工作曲线的绘制：分别取7份尿液平行样品于7个容量瓶中，每份1.0ml，分别加入1.0ml的内标工作液和3.0ml的水，然后再分别加入0.0ml、0.01ml、0.025ml、0.1ml、0.25ml、1.0ml、4.0ml的标准工作液，用甲醇定容到刻度，其中尿液样品中甲醇的体积浓度为60％，摇匀、过滤，利用uplc-ms/ms测定分析并建立标准工作曲线。

(2)样品前处理：取1位吸烟者的尿液样品，采集吸烟者尿液样品后，即时准确移取1.0ml的尿液样品于萃取瓶内套管中，加入1.0ml的内标工作液，3.0ml的水，再用甲醇定容到10ml(控制样品中甲醇的浓度为60％)。将尿液样品进行充分混匀，利用自制的样品前处理萃取瓶进行过滤和转移，并进行uplc-ms/ms检测。

(3)uplc-ms/ms检测，其测试条件为：

液相色谱条件：watersacquityuplctmbehc18(2.1×50mm,1.7μm)色谱柱，流速0.5ml/min，柱温30℃，进样量5.0μl。流动相a为0.05％的乙酸水溶液，b为甲醇，按0.0min(90％a)、1.0min(70％a)、3.0min(20％a)、5.0min(20％a)、6.0min(90％a)、8.0min(90％a)进行梯度洗脱；

质谱条件：电离源为电喷雾离子源，采用负离子扫描方式。喷雾电压(is)为：-4400v，离子源温度(tem)为：500℃，雾化气(gas1)压力为：50psi，进口电压(ep)为：-10v，气帘气压力(cur)为：30psi，出口电压(cxp)为：-10v，辅助雾化气(gas2)压力为：45psi，驻留时间为：100ms。

4种巯基尿酸及相应氘代内标的特征离子和质谱参数见表1。

表14种巯基尿酸及相应氘代内标的特征离子和质谱参数

*为定量离子

本实施例还考察了不同浓度甲醇对于4种巯基尿酸降解速度的影响，数据见表2。

表2甲醇浓度对巯基尿酸降解率的影响

本发明意外发现添加甲醇大大降低了4种巯基尿酸的降解速率，添加甲醇的原理主要是抑制尿液中各种酶的活性，避免在取完尿样后由于酶的继续作用而导致检测结果发生变化，这与加入酶抑制剂和无机盐抑制的原理是一样的，但是采用甲醇作为抑制剂不仅简化了操作，直接可以进行尿液的前处理，方便分析的进行；还可以保证了样品与分析色谱条件的一致性，不用再多增加步骤进行酶抑制剂的去除，也在一定程度上避免了多余酶抑制剂的色谱分析干扰。

通过检测，该吸烟者尿液样品中4种巯基尿酸的含量分别为：dhbma含量为251.4μg/l,3-hpma含量为760.8μg/l，cema含量为62.57μg/l，spma含量为7.94μg/l。

实施例2

为验证方法的精密度和回收率，按标准曲线浓度范围在实际尿液样品中加入已知量的对照品贮备液，加入量设置高、中、低3个浓度水平，每一浓度分别进样测定7次，连续测定7天，计算回收率及日内相对标准偏差、日间相对标准偏差，结果见表3。

表3方法回收率和精密度实验结果

从表3可看出，4种巯基尿酸的日内回收率均在93.9％～101.8％之间，日内相对标准偏差在2.0～3.4％之间；日间回收率均93.4％～102.1％之间，日间相对标准偏差在2.4～4.1％之间。说明本方法具有较好的回收率和精密度。

实施例3

以9个吸烟志愿者和3个非吸烟者的尿液为考察对象，按照不同抽烟习惯进行分类：重度抽吸者：25-50支/每人/每天、中度抽吸者：15-25支/每人/每天、轻度抽吸者：5-15支/每人/每天，测定其尿液中的4种巯基尿酸的含量，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立同实施例1。

(2)采集吸烟者尿液样品后，即时准确移取1.0ml的样品于萃取瓶内套管中，加入1.0ml的内标工作液，3.0ml的水，再用甲醇定容到10ml(控制样品的甲醇浓度为60％)。将尿液样品进行充分混匀，利用实验室自制的样品前处理萃取瓶进行过滤和转移，并进行uplc-ms/ms检测。

(3)uplc-ms/ms的测试方法同实施例1。

12个志愿者尿液样品检测结果见表2。

表412个尿液样品中4种巯基尿酸的测定结果

从表4结果可看出，人体尿液中的巯基尿酸含量和吸烟量具有一定的相关性，随着每天卷烟抽吸量的增加，其尿液中的4种巯基尿酸的含量逐渐升高。因此，通过4种巯基尿酸的测定可初步判断吸烟者卷烟烟气的暴露水平。