一种高粱中单宁的近红外检测方法与流程

本发明涉及高粱中单宁含量检测领域；具体地说，本发明涉及一种高粱中单宁的近红外检测方法。
背景技术：
：单宁是一类广泛存在于植物的果实、根、叶和皮等部位的复杂多元酚类化合物，它可以和蛋白质、生物碱、多糖等生物大分子及多种金属离子发生络合反应形成难溶于水的复合物。它所具有的特殊结构使其在医药、食品、饲料化工、环境等学科领域，均已得到了不同程度应用研究。随着全球变暖和全球粮食产量的下降，高粱已经成为人类食品和动物饲料资源中不可缺少的资源。养猪生产中，高粱越来越多地得到了使用以减少饲料的成本。然而，高粱籽实中含有抗营养因子，主要是单宁，它可以与蛋白质结合，降低蛋白质的消化率。高粱中单宁也会影响到猪能量的利用效率，单宁是决定或预测生长育肥猪代谢能的关键因素。高粱籽粒中的单宁含量影响生长猪的消化能和代谢能。单宁已成为衡量高粱营养价值的重要指标。对高粱中单宁的检测具有十分重要的意义。目前，应用于高粱中单宁检测的方法主要有分光光度法、滴定法、色谱法和试纸法。上述检测方法在整个检测过程中易受外界温度，且检测重复性差，对单宁的检测复杂，比如试纸法，需要配备溶液对高粱样品单宁进行提取液的制作和湿化学检测与分析，其测试工序复杂，耗时耗力，无法快速实现高粱中单宁含量的检测。技术实现要素：因此，本发明所解决的技术问题在于：实现高粱中单宁的快速检测，减少环境及制作溶液等各个工序对单宁检测准确度的影响，减少繁杂湿化学的高粱单宁检测与分析工序，本发明提供了一种高粱中单宁的近红外检测方法。所采用的技术方案如下：本发明提供了一种高粱中单宁的近红外检测方法，收集并选取多个品种的高粱籽实样品进行测定；对每个高粱籽实样品分别进行近红外光谱扫描和单宁含量的检测，获取每个高粱样品的单宁含量及对应的特征谱区的近红外光谱图；将各个高粱籽实样品的单宁含量与对应的光谱图关联后，建立单宁含量光谱预测模型；将所建立的光谱预测模型内置于近红外光谱扫描仪中，通过对高粱籽实进行近红外光谱扫描获取高粱中所对应的单宁含量。具体地，分别将各高粱籽实样品进行粉碎，经筛分后得到多组粒径小于0.5mm的粉碎颗粒；对粉碎颗粒按照gb/15686-2008进行单宁含量检测，获取每组粉碎颗粒的单宁含量值；通过近红外光谱扫描仪器对每组粉碎颗粒进行扫描，得到每组籽实样品特征谱区的光谱图。按照gb/15686-2008进行单宁含量检测，其中步骤8.3.2所采用的方法是，当日所测定样本用试管标号后，用移液器向所有试管中加入6ml水，待步骤8.3.1中的试样离心之后，分别向试管中加入1ml上清液混合均匀，再加入1ml氨溶液，然后旋紧盖子颠倒混合均匀10秒。按照gb/15686-2008进行单宁含量检测，其中步骤8.3.3采用的方法是，当日所测定样本用试管标号后，用移液器向所有试管中加入5ml水，待步骤8.3.1中的试样离心之后，分别向试管中加入1ml上清液混合均匀，再加入1ml柠檬酸铁铵溶液，然后旋紧盖子颠倒混合均匀10秒，然后用移液器加入1ml氨溶液，旋紧盖子颠倒混合均匀10秒。对每组粉碎颗粒进行近红外光谱扫描时，所采用的光谱区间为4000～12800cm-1。所述方法中还包括对预测模型的优化步骤：采用矢量归一化(snv)、最小-最大归一化、一阶导数(1d)、二阶导数(2d)、多元散射校正(msc)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化(snv)、一阶导数+多元散射校正(msc))等探索适用于高粱原料的光谱预处理方法，获得最优光谱预测模型。进一步地，所述的获得最优光谱预测模型的方法包括如下步骤：步骤1，建立定标集样品和验证集样品；步骤2，分别选取采用矢量归一化(snv)、最小-最大归一化、一阶导数(1d)、二阶导数(2d)、多元散射校正(msc)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化(snv)、一阶导数+多元散射校正(msc)光谱预处理方法；步骤3，利用定标集样品光谱数据，采用偏最小二乘方法(partialleastsquares，pls)结合全交互验证手段建立定标模型；根据定标集决定系数r2cal、定标集标准偏差rmsec、定标集交互验证决定系数r2cv、定标集交互验证标准误差rmsecv指标，确定最优预测模型；步骤4，采用验证集样品对最优预测模型进行外部验证，根据验证集决定系数r2val、验证集标准误差rmsep评价其外部预测能力。具体地，根据相对分析误差rpd值对所建立的最优预测模型进行评价，所建立的交互验证集相对分析误差rpd和验证集相对分析误差rpd分别是：交互验证集相对分析误差rpd＝sd/rmsecv；验证集相对分析误差rpd＝sd/rmsep；其中sd为样品集标准差。所述的定标集样品和验证集样品是将高粱籽实样品按7:3的比例随机分配，其中验证集样品化学值在定标集样品化学值的范围内。优选地，所建立的单宁含量光谱预测模型的最优预处理方法为一阶导数，特征谱区的吸收峰值为9401.9～7492.1cm-1和5451.8～4243.9cm-1。本发明技术方案，具有如下优点：a.本发明通过收集多个高粱籽实进行测试，获取高粱籽实中单宁的含量及近红外光谱，通过对特征谱区的选取建立了单宁含量与近红外光谱之间的关系，形成了单宁预测光谱模型；将预测光谱模型内嵌于近红外光谱扫描仪中，直接根据对高粱籽实样品的近红外扫描即可快速获得与光谱对应的单宁含量，检测准确性高，速度快，不需要进行湿化学单宁的分析即可获得单宁的含量，检测简单可行。b.本发明通过对高粱单宁含量检测方法中的加液顺序进行优化，在进行批量测定样品时，显著缩短了同批次样品中第一个样品到最后一个样品之间试样反应时间差，有效降低样品反应时间不一致所产生的误差问题，大大提高了高粱中单宁的检测效率和准确度，从而提高了建立模型的准确性。c.本发明对光谱预测模型采用一阶导数最优光谱预处理方法，吸收峰值为9401.9～7492.1cm-1，5451.8～4243.9cm-1，经验证：单宁含量预测光谱模型交互验证相对分析误差(rpdcv)为4.22，大于评估值3.0；外部验证相对标准差(rpdv)值为3.00，大于评估值2.5，经验证：所建立的单宁预测光谱模型效果良好，可用于日常监测。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明所提供的分光光度计比色建立的标准曲线图；图2是高粱籽实样品中单宁含量分布图；图3是高粱籽实样品中单宁的近红外反射光谱原始图；图4是高粱籽实样品中单宁近红外反射光谱一阶导数预处理光谱图；图5是高粱中单宁近红外反射光谱一阶导数+矢量归一化预处理光谱图；图6是本发明所提供的交叉检验预测值/真值；图7是本发明所提供的外部验证预测值/真值。具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种高粱中单宁的近红外检测方法，具体方法包括如下：步骤一，收集并选取多个品种的高粱籽实样品；本发明采集来自于国内不同地区及美国、巴西等不同高粱样品110份，全部样品自然风干至含水率低于15％，使用旋风磨(retschzm200型，德国)粉碎，过0.5mm标准筛。粉碎后每个样品采用四分法分为2份，装入自封袋中，干燥避光处存放，分别用于湿化学测定和近红外扫描。步骤二，对每个高粱籽实样品分别进行近红外光谱扫描和单宁含量的检测，获取每个高粱样品的单宁含量及对应的特征谱区的近红外光谱图。高粱中单宁含量采用《gbt15686-2008高粱单宁含量的测定》方法进行测定，单宁标准品购买为自默克公司的773单宁酸。通过测定获取每组粉碎颗粒的单宁含量值；为了缩短同批次样品中第一个样品到最后一个样品之间试样反应时间差，本发明对gb/15686-2008高粱单宁含量检测方法中步骤8.3.2和步骤8.3.3进行了优化。其中gb/15686-2008中步骤8.3.2所采用优化后的方法是，当日所测定样本用试管标号后，用移液器向所有试管中加入6ml水，待步骤8.3.1中的试样离心之后，分别向试管中加入1ml上清液混合均匀，再加入1ml氨溶液，然后旋紧盖子颠倒混合均匀10秒。gb/15686-2008中的步骤8.3.3所采用优化后的方法是，当日所测定样本用试管标号后，用移液器向所有试管中加入5ml水，待步骤8.3.1中的试样离心之后，分别向试管中加入1ml上清液混合均匀，再加入1ml柠檬酸铁铵溶液，然后旋紧盖子颠倒混合均匀10秒，然后用移液器加入1ml氨溶液，旋紧盖子颠倒混合均匀10秒。通过上述加液顺序进行优化，在进行批量测定样品时，可有效解决样品反应时间不一致的误差问题，大大提高了高粱中单宁含量检测效率和准确度，效果显著，从而提高了建立模型的准确性。同时还要对粉碎后的高粱籽实进行近红外光谱扫描，得到每组籽实样品特征谱区的光谱图。利用配备镀金积分球的傅里叶变换近红外光谱仪(brukertango型，德国)采集样品的近红外漫反射光谱，配备高能量空气冷却预准直近红外光源及硫化铅检测器。光谱扫描范围4000～12000cm-1，分辨率16ecm-1，扫描64次取平均值，旋转式样品池。样品重复装样扫描4次，取4次扫描光谱作为样本的原始光谱，如图3所示。步骤三，将各组高粱籽实样品的单宁含量与对应的光谱图关联后，建立单宁含量光谱预测模型。这里还包括对预测模型的优化步骤：采用矢量归一化(snv)、最小-最大归一化、一阶导数(1d)、二阶导数(2d)、多元散射校正(msc)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化(snv)、一阶导数+多元散射校正(msc)等探索适用于高粱原料的光谱预处理方法，获得最优光谱预测模型。具体获得最优光谱预测模型的方法包括如下步骤：步骤1，建立定标集样品和验证集样品；定标集样品和验证集样品是将高粱籽实样品按7:3的比例随机分配，其中验证集样品化学值在定标集样品化学值的范围内。步骤2，分别选取采用矢量归一化(snv)、最小-最大归一化、一阶导数(1d)、二阶导数(2d)、多元散射校正(msc)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化(snv)、一阶导数+多元散射校正(msc))光谱预处理方法；步骤3，利用定标集样品光谱数据，采用偏最小二乘方法(partialleastsquares，pls)结合全交互验证手段建立定标模型；根据定标集决定系数r2cal、定标集标准偏差rmsec、定标集交互验证决定系数r2cv、定标集交互验证标准误差rmsecv指标，确定最优预测模型；步骤4，采用验证集样品对最优预测模型进行外部验证，根据验证集决定系数r2val、验证集标准误差rmsep评价其外部预测能力。根据相对分析误差rpd值对所建立的最优预测模型进行评价，分别建立交互验证集相对分析误差rpd和验证集相对分析误差rpd，其中：交互验证集相对分析误差rpd＝sd/rmsecv；验证集相对分析误差rpd＝sd/rmsep；其中sd为样品集标准差。步骤四，将所建立的光谱预测模型内置于近红外光谱扫描仪中，通过对高粱籽实进行近红外光谱扫描即可快速获取高粱中单宁的含量。这里的对每组粉碎颗粒进行近红外光谱扫描时，所采用的光谱区间为4000～12800cm-1。其中所建立的单宁光谱预测模型的特征谱区的吸收峰值为9401.9～7492.1cm-1和5451.8～4243.9cm-1。定标模型评价指标:根据相对分析误差(rpd)值对模型进行更为详细的评价，交互验证集相对分析误差rpd＝sd/rmsecv，验证集相对分析误差rpd＝sd/rmsep，其中sd为样品集标准差。rpd≥3，说明定标效果良好，建立的定标模型可以用于实际检测；如果2.5<rpd<3.0，说明利用单宁预测光学模型对该成分进行定量分析是可行的，但预测精度有待于进一步提高；如果rpd<2.5，则说明该成分难以进行单宁预测光学模型的定量分析。本发明中按照国标《gbt15686-2008高粱单宁含量的测定》方法对110个高粱样品进行单宁含量测定。测定过程中使用shimadzuuv-2600分光光度计进行比色，比色中建立的其中的一次标准曲线见图1。r2为0.9998，拟合度非常高，符合试验标准要求。测定的单宁含量最低值为0.0111％，最大值为2.1207，平均值为0.5807％，标准差为0.5779。样品单宁含量分布图见图2。110个样品中单宁含量呈正态分布的趋势，范围在0.2838-0.3548区域的样品数量最多，占40.17％，依次为0.2129-0.2838和0.3548-0.4257范围内的样品。同时在对预测光谱模型进行预处理时，110个样品中近红外反射光谱原始图如图3。样品扫描时光谱范围设定为4000～12800cm-1。经过一阶导数如图4所示、矢量归一化(snv)、多元散射校正、二阶导数、一阶导数+矢量归一化光谱优化预处理，如图5所示。优化后，本发明优先选择一阶导数作为最优预处理方法。本发明依据rpd≥3评估，经过opus定量方法建立了高粱中单宁近红外光谱检测了定标预测模型，采用一阶导数最优光谱预处理，吸收峰值为9401.9～7492cm-1；5451.8～4243.9cm-1。定标参数及验证结果下表1。测试光谱样品为77个，校正光谱样品量为33个。交叉检验和外部验证中预测值/真值，如图6和图7。因此，单宁含量预测模型交互验证相对分析误差(rpdcv)为4.22，大于评估值3.0；外部验证相对标准差(rpdv)值为3.00，大于评估值2.5，说明所建立的模型效果较好，可用于日常监测。表1高粱中单宁定标预测模型参数及验证结果r2cvrmseerpd定标结果(calibration)97.50.09146.33交互验证结果(cross-validation)94.370.1324.22外部验证88.860.1793.00显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12