一种利用电感藕合等离子体质谱测定生物样本中聚苯乙烯磺酸镧含量的方法与流程

本发明涉及一种利用电感藕合等离子体质谱(icp-ms)测定大鼠和犬口服聚苯乙烯磺酸镧后大鼠血清、犬血清、大鼠粪便、大鼠尿液、大鼠脏器中镧的含量检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术：

苯乙烯磺酸镧散是辽宁诺康生物制药有限责任公司研制开发的化药1类新药，是一种新型的非钙磷酸盐结合剂，可用来控制慢性肾衰竭患者的高磷血症，尤其是存在高钙倾向的高磷血症患者。钙磷代谢紊乱是慢性肾脏病的常见并发症之一，高钙、高磷血症以及钙磷乘积升高是透析患者发生心血管疾病的重要危险因素，其引起的心血管并发症已经成为慢性肾衰竭(crf)透析患者死亡的主要原因，其中对于磷的控制一直是治疗慢性肾功能不全的一个难题。

近年来，含钙的磷结合剂主要为碳酸钙和醋酸钙得到广泛应用，可有效结合肠道磷，但最大不良反应是升高血钙。对于血钙控制不佳的高血磷患者，k/doqt强烈建议应用非钙非铝型磷结合剂。由我国自主研发的创新药苯乙烯磺酸镧散即是一种非钙非铝型磷结合剂，在整个消化道中均能去除磷酸盐。由于受试物主要在肠道中结合磷酸盐排除体外，吸收入血的量极低，这就需要根据药物的特点寻找一项最灵敏的检测方法，目的是检测聚苯乙烯磺酸镧散服用后在血清、脏器、尿液及粪便中的痕量镧含量，以研究本品的药代动力学特点，为产品的研发提供技术支持。icp-ms所用电离源是感应耦合等离子体(icp)，icp-ms的检出限大部分可达ppt级，具有快速灵敏的特点。针对聚苯乙烯磺酸镧低吸收的特点，我们选择了icp-ms的方法，对聚苯乙烯磺酸镧散在动物体内的药代动力学进行了研究。

技术实现要素：

按照本发明提供的技术方案，一种icp-ms测定大鼠和犬口服聚苯乙烯磺酸镧后犬血清和大鼠血清、脏器、尿液及粪便中镧的含量检测方法，步骤为：

(1)样本制备：自犬静脉取静脉血经3000r/min离心10min，分离上清，制备犬血清样本；各组织脏器，加入生理盐水制备10％组织匀浆；收集大鼠尿液及粪便，粪便晾干后称重，制备2％粪便匀浆。

(2)样本处理：取待测生物样本，先硝化，再高氯酸灼烧，以王水溶解残渣，加蒸馏水定容后，加入内标铑溶液。

(3)样本测试：采用icp-ms仪器建立测定beagle犬血清和大鼠血清、脏器、尿液及粪便中镧的含量的方法，并进行方法学验证。

(4)计算：取空白基质，分别加入聚苯乙烯磺酸镧制备浓度分别5、50、100、250、500μg/l的标准液，以待测物icps(强度值)为纵坐标y，待测物浓度为横坐标x，求得线性回归方程为y＝22656.699x-10882.973，r＝0.99993。以待测物和内标的峰面积比值代入标准曲线方程，计算各待测物的浓度。

步骤(1)所含生物样本包括犬血清、大鼠组织脏器(胃、肠、肺、前列腺、骨、骨骼肌、子宫、睾丸、心、脾、肝、肾、脑)以及大鼠尿液、粪便等。

步骤(2)具体操作为：在干净坩埚中准确加入待测生物样本0.5ml，加硝酸8ml，在电热板上120℃加热2h，放置过夜，加高氯酸2ml，电热板160℃加热4h，温度升至260℃,加热至白烟冒尽，加1+1王水4ml，溶解残渣，冷却后加蒸馏水定容至25ml，摇匀，进样测试。

步骤(3)中采用icp-ms仪进行检测，icp功率1250瓦，反射功率2瓦，取样锥孔径1.0mm，截取锥孔径0.7mm，analogue电压1800v，pc电压3000v，冷却气13.0l/min，辅助气0.7l/min，雾化气0.93l/min，采样深度141，水平78，垂直443。

检测内标采用铑元素，浓度为5μg/l。线性范围为5-500μg/l，定量下限为5μg/l。

本发明的有益效果：

该检测方法检测生物样本包含犬血清、大鼠组织脏器(胃、肠、肺、前列腺、骨、骨骼肌、子宫、睾丸、心、脾、肝、肾、脑)以及大鼠尿液、粪便等。适用范围广泛。

样本处理方法简单，样本采用先硝化，再高氯酸灼烧，以王水溶解残渣，加蒸馏水定容后检测，操作快速简便，重复性好，适用于常规检测。

该方法利用icp-ms仪检测生物样本中镧元素含量，灵敏度高，定量下限为5μg/l(定量下限rsd为5.86％)，适用于药代动力学研究。

附图说明

图1犬血清中镧标准工作曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例：beagle犬血清中镧的测定

1.实验材料和仪器

聚苯乙烯磺酸镧散(批号：20110501，镧含量：17.7％)，微黄色粉末；碳酸镧(批号：20110401，镧含量：52％)，白色粉末，均由辽宁诺康生物制药有限责任公司提供。内标元素铑：由国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院提供，编号：gsb-g-620379-90，浓度1mg/ml，用于分析时浓度为5ng/ml。硝酸：由苏州晶瑞化学有限公司提供，批号：8032090。

xseries2型等离子体质谱仪，thermo公司生产；yb502型电子天平，由上海海康电子仪器厂生产；yb502型电子天平，由上海海康电子仪器厂生产；tdl-5台式低速大容量离心机，江苏金坛市医疗仪器厂生产；xhf-1型高速分散器，由上海金达生化仪器厂生产。

2.icp条件及样本处理

2.1检测条件

采用电感藕合等离子体质谱仪进行检测。icp功率1250瓦，反射功率2瓦，取样锥孔径1.0mm，截取锥孔径0.7mm，analogue电压1800v，pc电压3000v，冷却气13.0l/min，辅助气0.7l/min，雾化气0.93l/min，采样深度141，水平78，垂直443。

2.2样本处理

在干净坩埚中准确加入待测血清0.5ml，加硝酸8ml，在电热板上120℃加热2小时，放置过夜，加高氯酸2ml，电热板160℃加热4小时，温度升至260℃,加热至白烟冒尽，加1+1王水4ml，溶解残渣，冷却后加蒸馏水定容至25ml，摇匀，进样测试。

3.方法学的建立

3.1标准曲线

取空白血清，分别加入聚苯乙烯磺酸镧母液配制浓度为5、50、100、250、500μg/l的标准液，按“2.2”项下依法操作，以待测物icps(强度值)为纵坐标y，待测物浓度为横坐标x，求得线性回归方程为y＝22656.699x-10882.973，r＝0.99993。根据标准曲线，聚苯乙烯磺酸镧中镧元素的线性范围为5-500μg/l。定量下限rsd为5.86％。标准曲线见图1。

3.2精密度

日内变异：取空白血清，分别加聚苯乙烯磺酸镧母液配制低、中、高三个浓度(血清浓度分别为10、250和500μg/l)的样品，按“2.2”项下依法操作，每一浓度分别配制分析5次，以标准曲线算得镧的浓度来计算日内变异系数，结果见表1-1。

表1-1.日内变异测定结果

日间变异：同前配制低、中、高三个浓度(聚苯乙烯磺酸镧含镧血清浓度分别为10、250和500μg/l)的样品，按“2.2”项下依法操作，每一浓度每天各分别配制分析5次，连续配制分析3天，以用标准曲线算得镧的浓度来计算日间变异系数，结果见表1-2。

表1-2.日间变异测定结果

3.3稳定性考察

血清处理样品室温放置稳定性：取空白血清，分别加入镧元素母液，配制聚苯乙烯磺酸镧含镧血清浓度分别为10、250和500μg/l的样品。按“2.2”项下处理，残留物以王水溶解，蒸馏水定容后室温放置6h，按“2.2”项下依法操作，测定含量，结果见表2-1。

表2-1.血清样品室温放置24h稳定性结果

血清样品反复冻融2次样本稳定性：同前制备聚苯乙烯磺酸镧含镧血清浓度为10、250和500μg/l的样品，置-20℃，冷冻-解冻后，按“2.2”项下依法操作，按标准曲线计算镧浓度，结果见表2-2。

表2-2.血清样品冷冻-解冻冻融稳定性结果

3.4提取回收率考察

取空白血清按“2.2”项下依法操作，残渣加入标准液配成浓度分别为10、250、500μg/l的应用液，直接进样，得应用液icps值a0。取空白血清，加入聚苯乙烯磺酸镧母液配制低、中、高3个浓度(聚苯乙烯磺酸镧镧浓度分别为10、250和500μg/l)的样品，按“2.2”项下依法操作，每一浓度进行5样本分析，得提取后icps值at。

以at/a0×100计算提取回收率。数据见表3。

表3.聚苯乙烯磺酸镧提取回收率(％，n＝5)

4.样本检测

检测8只犬口服0.75g/kg后，不同时间点血清中镧浓度，见表4.

表4.beagle犬口服聚苯乙烯磺酸镧中剂量(0.75g/kg)镧血药浓度(μg/l)

由表4可知，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为生物样本中镧元素血药浓度测定提供依据。