一种检测人血浆中伊立替康及其代谢产物含量的方法与流程

本发明涉及抗肿瘤药物的临床血药浓度测定
技术领域：
，尤其涉及一种检测人血浆中伊立替康及其代谢产物含量的方法。
背景技术：
：伊立替康是一种半合成的喜树碱衍生物，可以特异性抑制dna拓扑异构酶ⅰ，干扰dna复制和细胞分裂，从而产生细胞毒性，它的两个代谢产物sn-38和sn-38g也被证明有活性，是转移性结直肠癌的一线治疗药物，目前还应用于胃癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌等的治疗，是应用极为广泛的一种抗癌药物。由于体内代谢过程存在较大的个体差异，体内血药浓度与临床疗效和不良反应密切相关，检测其血药浓度从而调整剂量，减少不良反应，在临床用药中具有重大意义。目前常用的伊立替康血药浓度的测定方法主要是高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法。目前的高效液相色谱法存在前处理复杂，最低定量下限较大，分析时间长，消耗大量有机溶剂等问题。液相色谱串联质谱法可以缩短分析时间，精简前处理步骤，使检测结果更加准确。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种检测人血浆中伊立替康及其代谢产物含量的方法，采用hplc-ms/ms法，把内标法与高效液相色谱串联质谱法相结合，建立一种快速、灵敏的测定人血浆中雷替曲塞浓度的方法。具体技术方案如下：一种检测人血浆中伊立替康及其代谢产物含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：(一)标准溶液六个浓度以上的标准品的混合标准工作液，制成标准曲线系列溶液，所述标准品为伊立替康、sn-38、sn-38g，三个标准品共用一个内标溶液，所述内标溶液为伊立替康-d10溶液；(二)检测血液的离心取待检测血液至少2ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样本处理(1)用移液枪移取10μl内标工作液于1.5ml离心管中，加入50μl(三)中所述血浆，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；(2)用移液枪移取200μl含0.1-0.3％甲酸的甲醇溶液加入步骤(1)的离心管中，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；(3)用移液枪移取步骤(2)中的上清液200μl与1.5ml离心管中，加入50μl复溶液，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，得到的溶液即为待测样品；(四)待测样品的测定(4)标准曲线的制备首先将(一)种八种不同浓度的标准工作液50μl分别和950μl正常人空白血浆混合制成标准工作血药，按照(四)中的步骤进行处理，得到的标曲样品进仪器进行检测，得出上述八种标准溶液的伊立替康和内标色谱图，在色谱图中分别得到标准目标物峰面积和内标物峰面积，以标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝a×x+b，并且得出权重系数a和b。(5)待测样品的测定使用高效液相色谱串联质谱分析仪器对上述步骤(3)中待测的样品进行监测，得出上述待测样品的伊立替康和内标色谱图，在上述伊立替康和内标色谱图中得到待测目标物峰面积和内标峰面积，带入到(4)中的标准曲线方程中计算伊立替康的浓度。(六)hplc-ms/ms条件色谱条件：采用zorbaxeclipseplusc183.5μm,4.6×100mm色谱柱；柱温为35℃。流动相a相为甲醇，b相为含0.1％甲酸的水以55:45的比例进行等度洗脱。流速0.5ml/min,进样量5μl，分析时间3.6min。质谱条件：采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下，选择多反应检测模式的质谱扫描方式进行测定，伊立替康、sn-38、sn-38g和内标伊立替康-d10的母离子分别为为587.29、393.15、569.18、597.35，子离子分别为124、349.1、393.1、177.1，保留时间分别为2.60、4.20、2.61、2.59min。所述标准工作液浓度指标准工作液中所含有伊立替康及其代谢产物的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有伊立替康-d10的浓度。所述步骤(一)中使用九种不同浓度的标准工作液。所述九种不同浓度的标准工作液分别含有0.02、0.04、0.1、0.4、1.0、4.0、10、20、40ug/ml浓度的伊立替康、sn-38、sn-38g溶液。所述步骤(3)中使用的复溶液为55％甲醇-45％水(含0.1％甲酸)。与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：液相色谱串联质谱法测定血药浓度灵敏度高、专属性强、重现性好；一次分析即测出三个物质，极大程度的短了分析时间，减少了有机溶剂的用量进而降低对环境的污染；降低了最低定量下限。附图说明图1为实施例3中最低定量下限样本处理后伊立替康、sn-38、sn-38g和伊立替康-d10的典型色谱峰。图中，a-伊立替康，b-sn-38，c-sn-38g，d-伊立替康-d10具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不受附图和实施例所限。实施例1一种检测人血浆中伊立替康及其代谢产物含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：(一)标准溶液六个浓度以上的标准品的混合标准工作液，制成标准曲线系列溶液，所述标准品为伊立替康、sn-38、sn-38g，三个标准品共用一个内标溶液，所述内标溶液为伊立替康-d10溶液；(二)检测血液的离心取待检测血液3ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样本处理(1)用移液枪移取10μl内标工作液于1.5ml离心管中，加入50μl(三)中所述血浆，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；(2)用移液枪移取200μl含0.1％甲酸的甲醇溶液加入步骤(1)的离心管中，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；(3)用移液枪移取步骤(2)中的上清液200μl与1.5ml离心管中，加入50μl复溶液，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，得到的溶液即为待测样品；实施例2(一)标准溶液六个浓度以上的标准品的混合标准工作液，制成标准曲线系列溶液，所述标准品为伊立替康、sn-38、sn-38g，三个标准品共用一个内标溶液，所述内标溶液为伊立替康-d10溶液；(二)检测血液的离心取待检测血液3ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样本处理(1)用移液枪移取10μl内标工作液于1.5ml离心管中，加入50μl(三)中所述血浆，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；(2)用移液枪移取200μl含0.3％甲酸的甲醇溶液加入步骤(1)的离心管中，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；(3)用移液枪移取步骤(2)中的上清液200μl与1.5ml离心管中，加入50μl复溶液，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，得到的溶液即为待测样品；实施例3(一)标准溶液六个浓度以上的标准品的混合标准工作液，制成标准曲线系列溶液，所述标准品为伊立替康、sn-38、sn-38g，三个标准品共用一个内标溶液，所述内标溶液为伊立替康-d10溶液；(二)检测血液的离心取待检测血液2ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样本处理(1)用移液枪移取10μl内标工作液于1.5ml离心管中，加入50μl(三)中所述血浆，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；(2)用移液枪移取200μl含0.2％甲酸的甲醇溶液加入步骤(1)的离心管中，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；(3)用移液枪移取步骤(2)中的上清液200μl与1.5ml离心管中，加入50μl复溶液，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，得到的溶液即为待测样品；(四)待测样品的测定(4)标准曲线的制备首先将(一)种八种不同浓度的标准工作液50μl分别和950μl正常人空白血浆混合制成标准工作血药，按照(四)中的步骤进行处理，得到的标曲样品进仪器进行检测，得出上述八种标准溶液的伊立替康及其两个代谢产物和内标色谱图，在色谱图中分别得到标准目标物峰面积和内标物峰面积，以标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，数据见表1-3，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到三个目标化合物的标准曲线方程分别为y＝1.326×x+0.001，y＝0.270×x-0.0026，y＝0.270×x-0.0026。表1伊立替康线性关系相数据表2sn-38线性关系相数据进样名称待测物峰面积内标峰面积y值待测物血药浓度内标浓度x值sd1_01639446890.0143203800.053sd2_011157446270.0259403800.105sd3_012829447420.06321003800.263sd4_019055444570.20374003801.053sd5_0124095453180.53171.0×1033802.632sd6_0190218436992.06454.0×10338010.526sd7_01254854443115.751510.0×10338026.316sd8_014975454464011.145720.0×10338052.632sd9_0110404784166624.971940.0×103380105.263表3sn-38g线性关系相数据进样名称待测物峰面积内标峰面积y值待测物血药浓度内标浓度x值sd1_013092446270.0259403800.105sd2_018762447420.06321003800.263sd3_0129176444570.20374003801.053sd4_0180432453180.53171.0×1033802.632sd5_01296799436992.06454.0×10338010.526sd6_01800283443115.751510.0×10338026.316sd7_0115348424464011.145720.0×10338052.632sd8_0129867014166624.971940.0×103380105.263(5)待测样品的测定使用高效液相色谱串联质谱分析仪器对上述步骤(3)中待测的样品进行监测，得出上述待测样品的伊立替康及其两个代谢物和内标色谱图，在上述伊立替康及其两个代谢物和内标色谱图中得到待测目标物峰面积和内标峰面积的比值y代入到(4)中的标准曲线方程中，通过计算得到待测物中雷替曲塞的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到待测物中雷替曲塞的药物浓度。(六)hplc-ms/ms条件色谱条件：采用zorbaxeclipseplusc183.5μm,4.6×100mm色谱柱；柱温为35℃。流动相a相为甲醇，b相为含0.1％甲酸的水以55:45的比例进行等度洗脱。流速0.5ml/min,进样量5μl，分析时间3.6min。质谱条件：采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下，选择多反应检测模式的质谱扫描方式进行测定，伊立替康、sn-38、sn-38g和内标伊立替康-d10的母离子分别为为587.29、393.15、569.18、597.35，子离子分别为124、349.1、393.1、177.1，保留时间分别为2.60、4.20、2.61、2.59min，伊立替康及其两个代谢物与内标的典型色谱图见图1。方法学验证该方法的线性关系和定量限：按上述(4)中方法得到标准曲线，结果表明伊立替康及其两个代谢产物的线性范围和定量限如下：(1)定量限(loq)：伊立替康和sn-38为1ng/ml；sn-38g为2ng/ml。(2)线性范围：伊立替康和sn-38在1ng/ml到2000ng/ml范围内，线性良好，相关系数r2>0.99；sn-38g在2ng/ml到2000ng/ml范围内，线性良好，相关系数r2>0.99。该方法的回收率和精密度：取伊立替康及其两个代谢产物储备液配制成高、中、低3个浓度进行回收率和精密度实验，按实施例3进行预处理，按实施例进行测定，重复测定3个批次，其回收率和精密度如下表4.其在高、中、低3个浓度水平内的平均回收率为96.82％～106.02％，相对标准偏差为1.02％～9.05％。表4伊立替康及其两个代谢产物回收率和精密度综合上述验证实验，本方法的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中伊立替康及其两个代谢产物的药物浓度，重现性良好，回收率高，检测精确度高。本方法使用内标法进行定量，消除了系统误差，是目标化合物的分析更为准确，并且分析时间短、干扰小。当前第1页12