尿液中二甲苯代谢物的检测方法与流程

本发明涉及一种尿液中代谢物的检测方法，尤其是一种尿液中二甲苯代谢物的检测方法。
背景技术：
：生物监测是指对血液、尿液等人体生物材料中的化学物质及其代谢物含量或由它们产生的生物效应水平进行监测，可以反映机体不同途径及来源的化学物质的总接触量。二甲苯是工业上应用十分广泛的化学品，包括邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯三种异构体。工业上经常使用此三种异构体的混合物。长期接触二甲苯会对皮肤、内分泌、神经系统等产生有害影响。因此，对二甲苯的暴露水平进行生物监测在职业防护中是非常必要的。然而，目前针对该化合物的体内代谢物的检测方法的报道较少。cn103837624a公开了一种尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，将样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定。cn102788852a公开了一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中芳香胺化合物的方法，采用浓hcl水解尿液，并通过pah分子印迹柱对样品进行纯化处理，进液相色谱-串联质谱联用仪分析。cn106680393a公开了采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中环境荷尔蒙(例如邻苯二甲酸单甲基酯)，先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子-子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为x轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为y轴，建立校正曲线，计算环境荷尔蒙的含量。cn103175921a公开了一种液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢物的方法。上述方法采用液相色谱串联质谱检测一些芳香族化合物及其代谢物，但均不是二甲苯的代谢物。此外，cn103175921a采用固相萃取法分离代谢物，由于受萃取条件的限制，代谢物的检测也受到限制。此外，cn106442784a公开了一种人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的uplc-ms/ms检测方法，包括以下步骤：(1)样品的制备:取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，涡旋混匀，加与水等量的浓盐酸和水3倍质量的氯化钠，涡旋混匀后，加入样品量5倍的乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min，15000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，再加100μl的水复溶，取上清5μl进行样分析；(2)特定条件下uplc-ms/ms检测样本，(3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的浓度。上述方法采用液液萃取法分离代谢物，由于受萃取条件和检测条件的限制，仅能检测2-甲基马尿酸和3-甲基马尿酸，而无法全面地检测二甲苯的其他代谢物。技术实现要素：有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种尿液中二甲苯代谢物的检测方法，其可以较为全面地检测二甲苯代谢物。本发明另一个目的在于提供一种尿液中4-甲基马尿酸的检测方法，其可以准确检测尿液中的4-甲基马尿酸。一方面，本发明提供一种尿液中二甲苯代谢物的检测方法，包括如下步骤：(1)将尿液与溶剂a混合，然后离心，得到上清液；其中，溶剂a选自甲醇和乙腈中的一种或两种；所述尿液与溶剂a的体积比为1:1～20；(2)将上清液与溶剂b混合，得到样品液；其中，溶剂b选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；所述上清液与溶剂b的体积比为1:0.5～20；(3)采用液相色谱串联质谱检测样品液中的二甲苯代谢物；其中，二甲苯代谢物包括2-甲基马尿酸、3-甲基马尿酸和4-甲基马尿酸。另一方面，本发明也提供一种尿液中4-甲基马尿酸的检测方法，包括如下步骤：(1)将尿液与溶剂a混合，然后离心，得到上清液；其中，溶剂a选自甲醇和乙腈中的一种或两种；(2)将上清液与溶剂b混合，得到样品液；其中，溶剂b选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；所述上清液与溶剂b的体积比为1:0.5～20；(3)采用液相色谱串联质谱检测样品液中的4-甲基马尿酸。根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述尿液与溶剂a的体积比为1:2～5。根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，溶剂a为甲醇。根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述上清液与溶剂b的体积比为1:1～5。根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，溶剂b为超纯水。根据本发明的检测方法，优选地，步骤(3)的液相色谱串联质谱的条件如下：液相色谱条件：液相色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱的填料的粒径小于等于5.0μm，柱长为30～150mm；流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为体积百分数为0.005～0.2vol％的甲酸或乙酸的水溶液；流动相b为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的甲醇溶液，或者为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的乙腈溶液；流动相的流速为0.1～0.5ml/min；柱温为30～60℃；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为1～10μl；质谱条件：采用电喷雾电离源esi，采用负离子模式esi﹣；采用多反应监测模式mrm进行监测；毛细管电压为0.5～5kv；离子源温度为120～180℃。根据本发明的检测方法，优选地，梯度洗脱如下：0～1min，流动相a保持85vol％不变；1～10min，流动相a从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相a从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相a从25vol％升至85vol％。根据本发明的检测方法，优选地，在质谱条件中，碰撞能为10～20ev，锥孔电压为10～40v，定量离子对如下所示：化合物母离子(m/z)子离子(m/z)2-mha192913-mha192914-mha19291根据本发明的检测方法，优选地，采用外标法进行定量，以标准品浓度为x轴，以定量离子响应峰面积为y轴，建立标准曲线；将步骤(3)的液相色谱串联质谱得到的响应峰面积通过标准曲线进行定量，得出测量浓度；将所述测量浓度经过换算，得到待测化合物在尿液中的浓度c；换算公式如下：c＝c0×n式中，c0为测量浓度；n为稀释倍数。本发明的方法可以将二甲苯(包括邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯三种异构体)代谢物中的2-甲基马尿酸、3-甲基马尿酸和4-甲基马尿酸进行全面检测，从而更加真实地反映邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯的暴露水平。根据本发明优选的技术方案，可以将3-甲基马尿酸和4-甲基马尿酸分离开，从而将二者的含量分别检测出来。附图说明图1为实施例1的多反应监测(mrm)图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。2-甲基马尿酸(2-mha)，3-甲基马尿酸(3-mha)和4-甲基马尿酸(4-mha)是二甲苯(包括邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯三种异构体)的主要代谢物，可以作为二甲苯接触的生物标志物。现有技术的lc-ms仅能检测2-甲基马尿酸和3-甲基马尿酸，并不能检测4-甲基马尿酸。本发明的尿液中二甲苯代谢物的检测方法仅仅是为了评估接触者或未接触者的二甲苯代谢物状况，因而不涉及疾病的诊断和治疗。此外，上述代谢物状况与某种疾病并没有直接或间接的关系，因而不能用于诊断疾病。一方面，本发明提供的尿液中二甲苯代谢物的检测方法，包括如下步骤：(1)将尿液与溶剂a混合，然后离心，得到上清液；其中，溶剂a选自甲醇和乙腈中的一种或两种；(2)将上清液与溶剂b混合，得到样品液；其中，溶剂b选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；(3)采用液相色谱串联质谱检测样品液中的二甲苯代谢物；其中，二甲苯代谢物包括2-甲基马尿酸、3-甲基马尿酸和4-甲基马尿酸。另一方面，本发明提供的一种尿液中4-甲基马尿酸的检测方法包括如下步骤：(1)将尿液与溶剂a混合，然后离心，得到上清液；其中，溶剂a选自甲醇和乙腈中的一种或两种；(2)将上清液与溶剂b混合，得到样品液；其中，溶剂b选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；(3)采用液相色谱串联质谱检测样品液中的4-甲基马尿酸。上述两种检测方法均包括如下步骤：(1)除杂步骤；(2)稀释步骤；(3)检测步骤。下面统一进行详细描述。在步骤(1)中，将尿液与溶剂a混合，然后离心，得到上清液。将尿液与溶剂a混合之后，可以将尿液中的蛋白沉淀，从而减少对检测数据的干扰。通过离心分离将蛋白除去。离心的转速可选择8000r/min以上。溶剂a选自甲醇和乙腈中的一种或两种，优选为甲醇或乙腈，更优选为甲醇。本发明发现，甲醇更加有利于提高检测结果的准确性。在本发明中，所述尿液与溶剂a的体积比可以为1:1～20；优选为1:1～10，更优选为1:2～5。合适的尿液与溶剂a的比例可以将蛋白充分沉淀，从而改善检测准确性，并且可以节约有机溶剂用量。根据本发明的一个实施方式，所述尿液与甲醇的体积比可以为1:1～20；优选为1:1～10，更优选为1:2～5。在步骤(2)中，将离心后得到的上清液与溶剂b混合，得到样品液。这样可以将尿液样品稀释，减少尿液基质的干扰。溶剂b选自超纯水、甲醇和乙腈中的一种或多种；优选为超纯水或甲醇，更优选为超纯水。本发明发现，超纯水更加有利于提高检测结果的准确性。超纯水在本领域具有通常的含义，且可以容易地获得，这里不再赘述。上清液与溶剂b的体积比可以为1:0.5～20；优选为1:0.6～10，更优选为1:1～5。合适的稀释比例可以减少基质干扰，改善检测准确性。根据本发明的一个实施方式，上清液与超纯水的体积比为1:0.5～20；优选为1:0.6～10，更优选为1:1～5。在步骤(3)中，采用液相色谱串联质谱检测样品液中的二甲苯代谢物。二甲苯代谢物包括2-甲基马尿酸2-mha、3-甲基马尿酸3-mha和4-甲基马尿酸4-mha。本发明的方法可以同时检测三个以上代谢物。根据本发明的一个实施方式，检测的二甲苯代谢物仅由2-甲基马尿酸2-mha、3-甲基马尿酸3-mha和4-甲基马尿酸4-mha组成。根据本发明的一个实施方式，尿液中二甲苯代谢物的检测方法包括如下步骤：(1)将尿液与甲醇按照体积比为1:1～20混合，然后离心，得到上清液；(2)将上清液与超纯水按照体积比为1:0.5～20混合，得到样品液；(3)采用液相色谱串联质谱检测样品液中的二甲苯代谢物；二甲苯代谢物由2-甲基马尿酸2-mha、3-甲基马尿酸3-mha和4-甲基马尿酸4-mha组成。本发明的液相色谱串联质谱可以采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱。例如，超高效液相色谱(acquityuplci-class，美国waters公司)，三重四极杆质谱(xevotq-xs，美国waters公司)。下面详细描述液相色谱串联质谱的条件。在本发明中，液相色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱的填料的粒径小于等于5.0μm，柱长为30～150mm；流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为体积百分数为0.005～0.2vol％的甲酸或乙酸的水溶液；流动相b为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的甲醇溶液，或者为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸或乙酸的乙腈溶液；流动相的流速为0.1～0.5ml/min；柱温为30～60℃；洗脱方式为梯度洗脱；进样量为1～10μl。本发明的色谱柱的实例包括但不限于hsst3型色谱柱、behc18型色谱柱。反相色谱柱的填料的粒径小于等于5.0μm，优选为小于等于2.0μm。柱长为30～150mm，例如100mm。本发明的流动相包括流动相a和流动相b。流动相a为甲酸水溶液或乙酸水溶液；优选为体积百分数为0.005～0.2vol％的甲酸的水溶液或体积百分数为0.005～0.2vol％的乙酸的水溶液；优选为体积百分数为0.01～0.1vol％的甲酸的水溶液或体积百分数为0.01～0.1vol％的乙酸的水溶液。根据本发明的一个实施方式，流动相a为体积百分数为0.01～0.05vol％的甲酸的水溶液或体积百分数为0.01～0.05vol％的乙酸的水溶液；更优选为流动相a为体积百分数为0.01～0.05vol％的甲酸的水溶液。本发明的流动相b为甲醇、乙腈、甲酸的甲醇溶液、乙酸的甲醇溶液、甲酸的乙腈溶液或乙酸的乙腈溶液；优选地，流动相b为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.2vol％的乙酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.2vol％的甲酸的乙腈溶液或体积百分数为0～0.2vol％的乙酸的乙腈溶液；更优选地，流动相b为体积百分数为0～0.1vol％的甲酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.1vol％的乙酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.1vol％的甲酸的乙腈溶液或体积百分数为0～0.1vol％的乙酸的乙腈溶液。根据本发明的一个实施方式，流动相b为体积百分数为0～0.2vol％的甲酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.2vol％的乙酸的甲醇溶液；优选为体积百分数为0～0.1vol％的甲酸的甲醇溶液、体积百分数为0～0.1vol％的乙酸的甲醇溶液；更优选为甲醇。本发明的流动相的流速为0.1～0.5ml/min；优选为0.2～0.4ml/min。柱温为30～60℃；例如为30～50℃。进样量为1～10μl，优选为3～6μl。洗脱方式为梯度洗脱。优选地，洗脱程序如下：0～1min，流动相a保持85vol％不变；1～10min，流动相a从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相a从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相a从25vol％升至85vol％。在本发明中，采用电喷雾电离源esi，采用负离子模式esi﹣；采用多反应监测模式mrm进行监测；毛细管电压为0.5～5kv；离子源温度为120～180℃。本发明用多反应监测模式mrm进行监测可以进一步提高检测灵敏度和准确性。在本发明中，毛细管电压为0.5～5kv；优选为0.5～3.5kv。根据本发明的一个实施方式，毛细管电压：1.0kv。离子源温度为120～180℃，例如为150℃。在质谱条件中，碰撞能为10～20ev。锥孔电压为10～40v。在被测化合物不出峰期间，可切换质谱的在线切换阀至废液，以降低样品对质谱的污染。在质谱条件中，定量离子对如下所示：化合物母离子(m/z)子离子(m/z)2-mha19291；1493-mha19291；1494-mha19291；149优选地，定量离子对如下所示：化合物母离子(m/z)子离子(m/z)2-mha192913-mha192914-mha19291本发明采用外标法进行定量。以标准品浓度为x轴，以定量离子响应峰面积为y轴，建立标准曲线。选取2-mha、3-mha及4-mha配制不同浓度的标准系列溶液；所使用的溶剂选自超纯水、甲醇、乙腈中的一种或多种。所述标准系列溶液的个数为4～10个，优选5～8个。代谢物的标准溶液的最低浓度点分别为代谢物各自的定量限，为信噪比(s/n)≥10对应的浓度。2-mha、3-mha及4-mha的标准溶液的最高浓度点为：200～2000ng/ml。将液相色谱串联质谱得到的响应峰面积通过标准曲线进行定量，得出测量浓度。将所述测量浓度经过换算，得到待测化合物(二甲苯代谢物或4-mha)在尿液中的浓度c。c＝c0×n式中，c0为测量浓度；n为稀释倍数。下面介绍以下实施例的仪器与试剂：超高效液相色谱(acquityuplci-class，美国waters公司)，三重四极杆质谱(xevotq-xs，美国waters公司)；甲醇及甲酸为lc-ms级；2-mha、3-mha及4-mha的标准品纯度均大于98％。实施例1样品处理：将300μl尿液置于离心管中，加入900μl甲醇，旋涡振荡均匀，以15000r/min的转速离心15min，得到上清液。将500μl上清液置于新的离心管中，并加入2ml超纯水，涡旋振荡均匀，得到样品液。将1ml样品液置于2ml进样瓶，进样以分析2-mha、3-mha及4-mha的含量。标准溶液配制：以15vol％甲醇的水溶液为溶剂，配制不同浓度的标准溶液。2-mha、3-mha及4-mha的浓度范围：0.05～1000ng/ml。液相色谱条件：色谱柱为hsst3型色谱柱，填料的粒径为1.8μm，柱长为100mm。流动相：流动相a为体积百分数为0.04vol％的甲酸水溶液；流动相b为甲醇。流动相的流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样量：4μl。梯度洗脱：0～1min，流动相a保持85vol％不变；1～10min，流动相a从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相a从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相a从25vol％升至85vol％。质谱条件：2-mha、3-mha及4-mha采用负离子模式esi﹣；毛细管电压：1.0kv；多反应监测模式(mrm)；离子源温度：150℃。定量离子对、碰撞能及锥孔电压的选择如下表所示：表1方法学验证：采用外标法进行定量，建立标准曲线，所得标准曲线的r2均在0.995以上。信噪比(s/n)≥10对应的浓度确定为定量限，2-mha、3-mha及4-mha的定量限分别为50、50和50pg/ml。图1为实施例1的多反应监测(mrm)图。采用基质加标方式考察方法的准确度和精密度。分别配制低、中、高三个浓度水平的加标尿液，每组处理6份样品，测定回收率及批内精密度：2-mha、3-mha及4-mha的回收率在98～110％范围内；批内精密度在2.5～3.6％范围内。各个浓度基质加标样品分6次分别处理，测定批间精密度：2-mha、3-mha及4-mha的批间精密度在3.1～9.5％范围内。样品测试：采集某制鞋厂员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：2-mha、3-mha及4-mha的含量分别为12.952～5154.764ng/ml、18.650～10428.540ng/ml和11.077～4707.659ng/ml。采集某物业公司员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：2-mha、3-mha及4-mha的含量分别为5.760～40.313ng/ml、11.286～135.178ng/ml和6.270～67.055ng/ml。实施例2样品处理：将300μl尿液置于离心管中，加入900μl甲醇，旋涡振荡均匀，以15000r/min的转速离心15min，得到上清液。将500μl上清液置于新的离心管中，并加入2ml超纯水，涡旋振荡均匀，得到样品液。将1ml样品液置于2ml进样瓶，进样以分析4-mha的含量。标准溶液配制：以15vol％甲醇的水溶液为溶剂，配制4-mha不同浓度的标准溶液。4-mha的浓度范围：0.05～1000ng/ml。液相色谱条件：色谱柱为hsst3型色谱柱，填料的粒径为1.8μm，柱长为100mm。流动相：流动相a为体积百分数为0.04vol％的甲酸水溶液；流动相b为甲醇。流动相的流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样量：4μl。梯度洗脱：0～1min，流动相a保持85vol％不变；1～10min，流动相a从85vol％降至70vol％；10～13min，流动相a从70vol％降至25vol％；13～14min，流动相a从25vol％升至85vol％。质谱条件：4-mha采用负离子模式esi﹣；毛细管电压：1.0kv；多反应监测模式(mrm)；离子源温度：150℃。定量离子对、碰撞能及锥孔电压的选择如下表所示：表2方法学验证：采用外标法进行定量，建立标准曲线，所得标准曲线的r2在0.995以上。信噪比(s/n)≥10对应的浓度确定为定量限，4-mha的定量限分别为50pg/ml。采用基质加标方式考察方法的准确度和精密度。分别配制低、中、高三个浓度水平的加标尿液，每组处理6份样品，测定回收率及批内精密度：4-mha的回收率在100～110％范围内；批内精密度在2.7～3.6％范围内。各个浓度基质加标样品分6次分别处理，测定批间精密度：4-mha的批间精密度在3.1～4.2％范围内。样品测试：采集某制鞋厂员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：4-mha的含量分别为11.077～4707.659ng/ml。采集某物业公司员工的尿液20份进行测试，经尿比重校正得到以下结果：4-mha的含量分别为6.270～67.055ng/ml。本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。当前第1页12