一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法与流程

本发明涉及显微成像领域，尤其是涉及一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法。

背景技术：

在纵向实现高分辨率显微成像，对细胞分子活性研究具有重要意义。提高纵向分辨率的方法——包括三维结构光照明、光片照明技术——实现的纵向分辨率都在几百纳米量级，受到衍射极限的限制。为了打破衍射极限，满足生物医学对深亚波长量级的分辨率的需求，倏逝波被用于纵向层析成像。

然而，目前的倏逝波层析方法都是通过逐步改变全内反射角实现纵向的扫描。如公开号cn106226895a提供的一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；以及用于采集样品发出荧光的ccd。

上述现有技术需要对全内反射角进行精确控制，装置复杂。而且适用范围有限，比如在基于波导的倏逝波照明中，几乎无法改变全内反射角。开发一种适用范围广，操作方便、装置简易的深亚波长层析技术具有重要的实用价值。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种基于饱和光吸收的纵向层析成像方法，包括：

使用倏逝波照明样品，拍摄在某一激发强度的第一图像；

改变所述的激发强度，得到对应激发强度下的第二图像；

获取第一图像和第二图像的差值，除以激发强度的改变量，作为相应深度的层析信号。

本发明中，倏逝波存在于波导表面，激发强度越强，成像的位置距离产生倏逝波的界面越远。可通过改变激发强度，实现对纵向成像深度的扫描。

优选的，激发强度的改变量为相对改变量，表示前后两个激发强度的绝对差值与初始激发强度的比值。

所述的初始激发强度为得到第一图像时的激发强度，也可以理解为未改变时的激发强度。

更具体地，改变所述的激发强度，可以是逐步增加激发强度，也可以是逐步减小激发强度；具体可根据需要旋转。

优选的，所述的样品为具有饱和光吸收效应的荧光染色样品。

优选的，将激发光耦合进入波导中，波导表面产生倏逝波，照明置于波导表面的样品。

进一步优选的，按比例逐步增加激发光的强度，实现成像深度相对于倏逝波产生的界面由近及远的扫描。

本发明可选择脉冲光或连续光作为激发光。优选的，所述激发光为脉冲光，单个脉冲的脉宽小于荧光染色剂的荧光寿命。

优选的，激光强度增加的比例与对深度的扫描步长之间的关系以及纵向分辨率为：

其中，δz为深度扫描步长；rz为纵向分辨率；α为脉冲光强度增加的比例，λ为激光波长；neff为倏逝波横向波矢分量与物空间光波矢大小的比值。

并列优选的，所述倏逝波为连续光，或脉冲时间大于荧光染色剂的荧光寿命的脉冲光。

优选的，激光强度增加的比例与对深度的扫描步长之间的关系以及纵向分辨率为：

其中，δz为深度扫描步长；rz为纵向分辨率；α为脉冲激光增加的比例，λ为激光波长；neff为倏逝波横向波矢分量与物空间光波矢大小的比值。

本发明具有的有益效果是：

易于操作，适用范围广，可与基于波导的倏逝波照明集成，实现片上深亚波长层析成像。

附图说明

图1是基于波导倏逝波照明的纵向层析器件示例图；

图2是通过成像对激发强度的差分而获得的某一深度的层析示例图；其中，(a)图表示三维的物，(b)图表示某一激发强度下所成像的强度分布，(c)图表示激发强度增加了10％所成像的强度分布，(d)图表示b与c两幅像相减除以10％后的强度分布；

图3是对一颗荧光颗粒通过改变激发强度进行纵向扫描成像的强度分布曲线；其中，(a)表示重构出的三维的像。(b)为沿a图中黑色虚线所描出的强度分布图。

图中：i、波导，ii、倏逝波，iii、样品。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

以基于波导的倏逝波照明为例。将皮秒脉冲激光耦合进入平板波导i中，平板波导表面产生倏逝波ii。样品iii经过荧光染色后，置于波导表面被倏逝波照明。最开始时使倏逝波处于较弱状态，防止距离波导表面较近的荧光颗粒饱和。对于每一个激发强度，将激发光改变一个微小量(比如改变10％)，前后拍摄两幅照片进行相减，将差值除以激发光的改变量作为信号。不同的激发强度对应于不同的成像深度，按一定比例逐步增加脉冲激光的强度，实现成像深度相对于波导表面由近及远的扫描。脉冲激光增加的比例与对深度的扫描步长之间的关系以及纵向分辨率为：

其中，δz为深度扫描步长；rz为纵向分辨率；α为脉冲激光增加的比例，λ为激光波长；neff为倏逝波横向波矢分量与物空间光波矢大小的比值。比如，当neff＝3.7，λ＝470nm时，可取得26nm的纵向分辨率；当希望以2nm为步长对样品进行扫描时，需要以21％的比例逐步增加激发光强度。

当使用连续光或脉宽大于荧光染色剂的荧光寿命时，荧光染色剂的饱和吸收曲线的形式会从e指数型变成多项式型。此时，激光增加的比例与对深度的扫描步长之间的关系以及纵向分辨率为：

其中，δz为深度扫描步长；rz为纵向分辨率；α为脉冲激光增加的比例，λ为激光波长；neff为倏逝波横向波矢分量与物空间光波矢大小的比值。

应用举例

使用磷化镓材料(折射率3.73@470纳米波长)制作波导，厚度为500nm，波导下为sio2衬底。使用470纳米波长的激发光。基模的有效折射率为3.7。图2(a)图表示三维的物，图2(b-c)显示了在某一激发强度及该激发强度增加了10％的情况下，所成的两幅像。图2(d)显示了它们的差值，差值结果对应了某一深度的层析图。图3(a)显示了对一个三维的样品通过改变激发强度进行纵向扫描成像后，重构出的三维的像。图3(b)中一颗荧光颗粒的强度分布曲线显示，可以实现26纳米的纵向分辨率。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。