一种精准的体外药物心脏安评方法与流程

本发明涉及药物安全性评估技术领域，具体是一种精准的体外药物心脏安评方法。

背景技术：

心脏安全性评估是各类新药进入临床试验前必须考量的一个重要的以动物或动物组织为主的实验程序。在过去几年中，一些已投入临床应用的药物因为其潜在的心脏毒性或能引起严重的心律失常而被迫从市场撤回或推迟批准进入市场，如阿司咪唑、特非那定、西沙必利及格帕沙星等。人用药品注册技术要求国际协调会（ich）明确规定：新药在进入临床应用前，必须进行动物和人体的心脏安全性评估。目前，主要通过herg和qt间期检测来预测心律失常风险，但其相关机制研究表明，herg阻滞与致心律失常风险和临床qtc延长的相关性不完全一致，即使用herg检测预测qt间期延长的可靠性并不高。然而qt间期延长也不一定引起致命性心律失常，例如阿呋唑嗪、苯巴比妥和雷诺嗪都可以延长qt间期，但不会导致尖端扭转型室性心动过速（tdp）。qtc是通过ecg来获得，许多研究表明ecg并不能完整地反映心脏完整的复极化信息，因此以qt间期作为衡量心脏整体复极化的检测指标的可靠性并不高。然而，研究发现qt延长与动作电位持续时间的异质性相关，动作电位持续时间异质性又是导致心律失常的重要基础，而体表ecg无法检测到这种异质性，因此，在临床前增加药物延迟心室复极的相关实验刻不容缓。药物延迟心室复极的相关实验主要通过动作电位实验来检测，至今为止，对于心室复极化恢复90%的时间的选择无章可循，这样会导致我们对于评估药物心脏风险存在一定的误差。由于评价药物对心脏是否安全是一个相当复杂的过程，在很多时候，由于实验设计不严谨从而增加假阳性或假阴性的概率很多，它可以使一个本身具有很好潜力的药物因此而被放弃，这将对任何制药企业都会造成无法衡量的损失，因此制定一种精准的体外药物心脏安评方法迫在眉睫。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明公开了一种精准的体外药物心脏安评方法。

本发明的技术方案为：一种精准的体外药物心脏安评方法，包括下列步骤：

（1）动作电位频率设计：用三组不同刺激频率包含60个脉冲来刺激浦肯野纤维在不同刺激频率下发动的动作电位，三组刺激频率周期分别为2000ms、1000ms和500ms；

（2）动作电位记录：将兔浦肯野纤维放置在灌流浴槽中，按5ml/min的速度灌流台氏液，采用标准玻璃微电极法，蒲肯野纤维首先以1s基础刺激周长灌流台氏溶液30分钟以上，使其稳定和恢复正常的兴奋性；30分钟后将灌有3m的kcl溶液的玻璃微电极插入标本，引出动作电位，刺激频率1hz，采样频率10khz，每一例观察实验项目的全过程均在同一细胞上完成，蒲肯野纤维在稳定后灌流溶剂对照15分钟，在1hz的刺激频率下动作电位稳定后，再给予2000ms、1000ms和500ms的频率刺激分别记录60个稳定的动作电位，然后化合物由低到高的浓度对蒲肯野纤维依次连续进行灌流15分钟，分别重复上述刺激频率记录动作电位，刺激程序与溶剂对照时相同。

本发明的有益之处：确定了对动作电位时程选择的适宜范围，建立标准化体外动物心脏安评平台可以更精准、更有效的评估药物对心脏的安全风险，使得药物能得到高通量、高效率的筛选，从而更好的防止药物临床心律失常的假阴性或假阳性的出现。

附图说明

图1是本发明中动作电位持续时间与k系数关系图；

图2是本发明中动作电位持续时间适宜范围的选择图；

图3是本发明中k系数对多菲利特作用效应影响图；

图4是本发明中k系数对多菲利特频率依赖性的影响图；

图5是本发明中药物（apd90）的相关系数k与其浓度的关系图；

图6是本发明中药物（apd60）的相关系数k与其浓度的关系图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面结合附图详细描述本发明的具体实施方式，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的保护范围的限定。

一种精准的体外药物心脏安评方法，包括下列步骤：

（1）动作电位频率设计：用三组不同刺激频率包含60个脉冲来刺激浦肯野纤维在不同刺激频率下发动的动作电位，三组刺激频率周期分别为2000ms、1000ms和500ms；

（2）动作电位记录：将兔浦肯野纤维放置在灌流浴槽中，按5ml/min的速度灌流台氏液，采用标准玻璃微电极法，蒲肯野纤维首先以1s基础刺激周长灌流台氏溶液30分钟以上，使其稳定和恢复正常的兴奋性；本发明发现只有动作电位时程apd90³180ms的蒲肯野纤维动作电位才可以用于后续的实验（以确保实验的精准性）。30分钟后将灌有3m的kcl溶液的玻璃微电极插入标本，引出动作电位，刺激频率1hz，采样频率10khz，每一例观察实验项目的全过程均在同一细胞上完成，蒲肯野纤维在稳定后灌流溶剂对照15分钟，在1hz的刺激频率下动作电位稳定后，再给予2000ms、1000ms和500ms的频率刺激分别记录60个稳定的动作电位，然后化合物由低到高的浓度对蒲肯野纤维依次连续进行灌流15分钟，分别重复上述刺激频率记录动作电位，刺激程序与溶剂对照时相同。

本发明主要将药物临床前心脏风险评估方法中的动作电位记录进行了一个实验标准化的探索并且根据结果建立标准化实验方法，实验结果如下：

（1）如图1所示，x轴表示刺激频率（2000ms、1000ms和600ms），y轴表示心室复极化时间，分析apd90>180ms与apd90<180ms对应系数k的区别，结果发现apd90>180ms时，k值为28.1，则呈现出很好的频率依赖性；apd90<180ms时，k值为3.6，则不存在频率依赖性；即apd90值越大，系数k则越大，反之越小。

（2）如图2所示，x轴1hz下的apd90，y轴表示频率的相关系数（k），将所有的control实验进行总结分析，结果发现apd90>180ms时k呈现出上升趋势。

（3）如图3所示，x轴1hz下的apd90，y轴表示1μm多菲利特对其作用的百分比变化值，结果发现随着心室复极化时间的增加，多菲利特对动作电位的作用也随之增强。

（4）如图4所示，x轴表示刺激频率（2000ms、1000ms和600ms），y轴表示心室复极化时间，通过选择在1hz下的apd90，分别为>180ms和<180ms，再分给别看对应的多菲利特作用进行频率相关系数k的比对，结果发现apd90>180ms的k值明显比apd90<180ms得k值大。

技术特征：

技术总结
本发明公开一种精准的体外药物心脏安评方法，主要包含动作电位持续时间与频率相关系数K值有关（K值为动作电位时程与频率拟合曲线的斜率），此发明实验证明，K系数关系到药物对动作电位频率依赖性的结果，此结果会直接影响到药物的心脏安全风险评估结果。因此，利用此系数K在实验上标准化可以更精准、更有效的评估药物心律失常的风险，以及防止药物临床前心律失常假阳性或假阴性的出现，K系数标准化可以实现更高效率、高通量的药物筛选。

技术研发人员：张之颢;宋雷
受保护的技术使用者：南通科瑞斯生物医药科技有限公司
技术研发日：2018.12.05
技术公布日：2019.05.17