研究磁场对DNA二维折纸结构稳定性影响的方法与流程

本发明基于大气下原子力显微镜和荧光分光光度计的表征方法，公开了一种研究磁场对dna二维折纸结构稳定性影响的方法。具体涉及到改变dna三角折纸结构所处的磁场强弱并维持一定时间，然后结合原子力显微镜和荧光分光光度计来分析其形貌变化和双链之间键合情况。本发明属于纳米检测领域。

背景技术：

dna折纸术是目前非常流行的一种制备二维或三维dna纳米结构的方法，其只需将一条长的dna单链和一系列部分序列互补的dna短链按照比例混合之后，按照一定的退火程序退火即可。而所合成的纳米结构的形状易于编辑，只需要更改加入的短链的序列即可，且短链的序列可以通过计算机编辑得到，非常简便。除此之外，dna结构上容易通过巯基，胺基，羧基等修饰上不同生物大分子以实现不同的性能。且由于其是生物体内本身就存在的物质，故而有着卓越的生物相容性。

dna折纸结构由于以上优点而被广泛应用于药物载体的制备（中国发明专利：利用dapi嵌入和释放模拟dna纳米折纸结构作为药物载体的方法，公开号：cn105004703a），生物传感器（中国发明专利：基于适配体修饰的dna折纸纳米结构-纳米金的生物传感器及其制备方法和应用，公开号：cn104962615a），纳米检测（中国发明专利：基于dna纳米结构的17β-雌二醇可视化检测方法及检测试剂盒，公开号：cn104975079a）等领域。而dna折纸结构纳米级的可寻址性，可控排布性和任意位置的可修饰等特性，又赋予了其用作纳米电路方面的无限想象，因此有研究者已经开始尝试用dna来引导颗粒组装纳米导线（中国发明专利：dna引导纳米颗粒组装垂直型导线的制备方法，公开号：cn1994863a），并开始了利用dna来设计逻辑电路的研究（中国发明专利：一种基于dna双螺旋结构的光激性逻辑电路的设计方法，公开号：cn106027033a）。

上述这些dna折纸的应用，都建立在折纸本身结构的完整性的基础上，因此，国内外的工作者深入研究了折纸结构在各种条件下的稳定性，发现其在浸入乙醇，丙酮等有机溶剂中都可以保持结构完整性，而在细胞裂解液中则会发生结构的破坏。虽然对于折纸结构的稳定性的研究已经非常详尽，但目前仍未有研究涉及到折纸结构在磁场环境下稳定性，而这对于折纸结构应用于肿瘤的靶向治疗、磁疗对于人体的影响，或是纳米电路方面的应用都有着非常重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种研究磁场对dna二维折纸结构稳定性影响的方法。

本发明目的通过下述方案实现：一种研究磁场对dna二维折纸结构稳定性影响的方法，以dna二维折纸结构为基材，改变dna二维折纸结构所处的磁场强弱并维持一定时间，然后结合原子力显微镜和荧光分光光度计来分析其形貌变化和双链之间键合情况，包括以下步骤：

（1）环境磁场强度的改变

环境磁场的改变设计：将含有dna二维折纸结构溶液置于强磁场实验装置（如中科院强磁场实验装置（shmff））中进行磁化处理，改变该dna二维折纸结构溶液所处位置的磁场强度形成磁场梯度变化并维持0.5h-70h，其中，磁场强度为0t-27t，梯度为0t/m-180t/m；

（2）对于dna二维折纸形貌观察

用云母片构建界面，取3μl磁场处理后的dna二维折纸结构溶液滴加到新剥离的云母片上沉积3min，用超纯水冲洗掉界面上的盐分，氮气吹干最后置于大气下扫描探针显微镜下观察，显微镜型号为veeco公司的型号为moltimodenanoscopevii的仪器，所述成像模式为轻敲模式。对于形貌的观察还可使用其他型号的扫描探针显微镜，均不会对结果产生实质性影响；

（3）折纸结构荧光信号观察

取18μl磁场处理后的dna二维折纸结构溶液，向其中加入77μl1×taemg²⁺溶液，再加入至少5μl荧光染料混合均匀后转移到微量比色皿中，置于荧光分光光度计下观察。

所述dna二维折纸的合成按下述步骤：

将208根订书钉链等量地溶解到超纯水中，使每条链的最终浓度为200nm，将m13mp18单链dna（100nm）与混好的短链(200nm)以摩尔浓度比1：10的比例混合在1xtae-mg²⁺溶液中，其中m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm，将混合后的溶液放入pcr仪中，设定反应程度从95℃缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s，其中，1xtae-mg²⁺溶液的成分为：40mm三(羟甲基)氨基甲烷（tris），20mm醋酸（aceticacid），2mm乙二胺四乙酸（edta），12.5mm醋酸镁（magnesiumacetate），ph8.0。

其中，所述长链为m13噬菌体单链，7249bp；所用订书钉链的序列为dna三角折纸序列，即所用订书钉链的的序列为2006年发表在nature上的题为“foldingdnatocreatenanoscaleshapesandpatterns”三角折纸序列（supportinginformation，41页）。

在上述方案基础上，通过改变仪器设定来改变dna折纸结构所处的磁场强度，将，将的dna二维折纸浓度为1nm的溶液置入不同梯度的磁场环境下并维持30min（注：溶液的量尽量少以避免不同位置的dna折纸结构所处的磁场强度不同），然后取出，尽快观察。

在上述方案基础上，步骤（3）中，所用荧光染料为evagreen染料，具有比其他核酸染料更高的灵敏度，且没有“染料重分布”的缺陷。向一定量的磁场处理后的折纸溶液中加入足量的evagreen荧光染料，混合均匀后置于比色皿中，然后在荧光分光光度计下观察。evagreen染料是一种稳定，具有极高灵敏度的dna荧光染料，当它结合在dna双链之间时，荧光信号会增加100倍以上。所用荧光分光光度计型号为hitachi公司的f-7000。

在上述方案基础上，改变dna二维折纸结构溶液所处位置的磁场强度，磁场强度为15t-27t，梯度为45t/m-180t/m；改变折纸溶液所处位置的磁场强度并维持时间为0.5h-70h。

本发明基于大气下扫描探针显微镜和荧光分光光度计，公开了一种研究磁场对dna二维折纸结构稳定性影响的实验方法，具体涉及到对dna三角折纸结构施加不同强度的磁场环境，观察其各自的形貌变化及双链间的键合情况。这一方法同样适用于其他二维可插入荧光分子的材料的观察上。

本发明的优点在于：

（1）本发明提出了一种探究磁场对dna二维纳米结构的影响的实验方法。

（2）基于扫描探针显微镜的观察操作简便，形貌清晰。使用云母片构建界面，易于实现，且可探究的因素多，移植性强。

（3）基于荧光分光光度计的结构分析操作简便，，与双链键合情况对应性强，准确性好。

（4）本方法适用于探究磁场对多种二维可插入荧光分子的平面材料的的影响。

附图说明

图1为dna三角折纸结构在15t,135t/m的磁场强度处理后的形貌图；

图2为dna三角折纸结构在不同磁场强度下的荧光分析图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

材料准备：dna三角折纸结构合成：

将208根订书钉链等量地溶解到超纯水中，使每条链的最终浓度为200nm，将m13mp18单链dna（100nm）与混好的短链(200nm)以摩尔浓度比1：10的比例混合在1xtae-mg²⁺溶液中，其中m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm，将混合后的溶液放入pcr仪中，设定反应程度从95℃缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s，其中，1xtae-mg²⁺溶液的成分为：40mm三(羟甲基)氨基甲烷（tris），20mm醋酸（aceticacid），2mm乙二胺四乙酸（edta），12.5mm醋酸镁（magnesiumacetate），ph8.0。

其中，所述长链为m13噬菌体单链，7249bp；所用订书钉链的序列为dna三角折纸序列为2006年发表在nature上的题为“foldingdnatocreatenanoscaleshapesandpatterns”三角折纸序列（supportinginformation，41页）。

实施例1

在中科院强磁场实验装置（shmff））中对三角折纸溶液（1nm）进行磁化处理，磁场强度15t，梯度135t/m，磁场强度处理后dna三角折纸的形貌观察：

将云母片固定在铁片上，取3μl磁场下处理过的三角折纸溶液（1nm）沉积到新剥离云母片上洗去盐分并氮气吹干，置于扫描探针显微镜下观察其形貌变化，如图1所示，dna三角折纸为规则的三角形，三个角锐利可见。当将其放置于磁场强度为15t，磁场梯度为135t/m的磁场中30分钟后，形状发生改变，三角形结构解体。图中可见不规则颗粒状dna，为折纸解体后的聚集体，部分三角仍然保持了模糊的形状，但是高度图可见其高度变高，说明其形状正在逐渐解体过程中。

15t,135t/m的磁场强度处理后dna三角折纸的荧光分析：

取18μl处理后的折纸溶液，向其中加入77μl1×taemg²⁺溶液，在加入5μl20×evagreen染料，混合均匀后转移到微量比色皿中，置于荧光分光光度计下观察，如图2所示，坐标横轴为磁场强度（t），磁场梯度（t/m）。纵坐标为dna折纸结构放置于磁场30分钟后，使用荧光光谱，测得的荧光吸收值，dna结构中加入足量的evagreen荧光染料，这种染料只有在dna结构保持完整时才会发光。因此吸收值越大，表明dna结构越完整。图中是磁场强度和梯度共同作用的结果。

实施例2

与实施例1近似，只是磁场强度26.8t，梯度45t/m，磁场强度处理后dna三角折纸的形貌观察：

将云母片固定在铁片上，取3μl磁场下处理过的三角折纸溶液（1nm）沉积到新剥离云母片上洗去盐分并氮气吹干，置于扫描探针显微镜下观察其形貌变化。

26.8t,45t/m的磁场强度处理后dna三角折纸的荧光分析：

取18μl处理后的折纸溶液，向其中加入77μl1×taemg²⁺溶液，再加入5μl20×evagreen染料，混合均匀后转移到微量比色皿中，置于荧光分光光度计下观察，如图2所示。

实施例3

与实施例1近似，只是磁场强度20.5t,梯度180t/m的磁场强度处理后dna三角折纸的形貌观察：

将云母片固定在铁片上，取3μl磁场下处理过的三角折纸溶液（1nm）沉积到新剥离云母片上洗去盐分并氮气吹干，置于扫描探针显微镜下观察其形貌变化。

20.5t,180t/m的磁场强度处理后dna三角折纸的荧光分析：

取18μl处理后的折纸溶液，向其中加入77μl1×taemg²⁺溶液，在加入5μl20×evagreen染料，混合均匀后转移到微量比色皿中，置于荧光分光光度计下观察，如图2所示。