一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法与流程

本发明属于磷酸酶活性检测领域，具体涉及一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法。

背景技术：

酶是决定生物系统化学转化模式的重要分子器件。几乎在所有的生物体中，酶促反应都起着非常重要的作用，即使在单个细胞中，也存在数千种酶促反应为生物体正常的代谢和繁殖提供资源和能量。无机焦磷酸酶（ppase，一种普遍存在的水解酶），它可以特异催化一分子焦磷酸盐（p2o7^4-，ppi）转化为两个磷酸盐分子（po4^3-，pi）。ppase酶催化ppi水解反应是一种高能放电反应，因此，它可以被用于一些能量不良的生化反应，以推动或补充这些反应。另外，ppase还被报道与一些生物反应（如脂肪合成与降解、磷代谢、碳水化合物代谢、dna合成、钙吸收、骨形成）和临床疾病（如肺腺癌、甲状腺机能亢进、结直肠癌）的关系。

传统的检测ppase的方法主要是通过对已释放的pi进行分析，或者使用放射性标记的ppi模拟天然底物，但这些方法耗时，费力，灵敏度低。后又有人提出用比色/荧光分析检测ppase的活性，但是这些方法往往涉及标记策略。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法。

本发明所采取的技术方案如下：一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法，包括以下步骤：将焦磷酸、待测活性的无机焦磷酸酶混合反应，然后加入铜盐，继续反应，得到待测反应液，然后通过黑磷检测铜离子的电化学信号，得到电化学响应信号。

由于黑磷纳米材料对铜离子有极强的特异性吸附作用，因此，我们提出了一种基于黑磷-酶水解诱导铜离子释放的半均相电化学策略用于检测焦磷酸酶活性。当目标物焦磷酸酶不存在时，焦磷酸与铜离子之间强的相互作用，使得反应液中的铜离子不能吸附在滴涂有黑磷纳米片的玻碳电极上，因此，检测到极低的铜离子电化学信号；反之，当焦磷酸酶存在时，焦磷酸酶可以催化底物焦磷酸水解，抑制了焦磷酸-铜离子复合物的形成，反应液中的铜离子可以有效的吸附在滴涂有黑磷纳米片的玻碳电极表面，检测到极强的铜离子电化学信号。本发明中提到的这种方法，铜离子的电化学信号与焦磷酸酶的浓度呈现正相关，且可以有效监测外部因素对焦磷酸酶活性的抑制效应。这种方法操作简单，无需标记和复杂的操作，对焦磷酸酶活性检测的选择性高，灵敏度高，有望应用于临床诊断与焦磷酸酶相关的疾病及探究焦磷酸酶在生物体系中的作用机制。

通过黑磷检测铜离子的电化学信号采用滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极检测，所述滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极通过以下过程得到：将黑磷纳米片置于超声仪中超声1-3h，然后加5-15v电压，电解黑磷纳米片溶液15-45min，然后再置于超声仪中超声1-3h，得到黑磷溶液，取黑磷溶液滴在玻碳电极上，干燥后得到滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极。对黑磷溶液进行超声-电解-超声的目的是剥离黑磷纳米片

将所述的待测反应液滴加到滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极表面，反应至少4h，然后洗去反应液，吹干，置于含有kno3的缓冲液中测方波伏安法，电势窗口选择为-0.3v-0.2v，电位跃为4mv，振幅为25mv，频率为25hz。

所述待测反应液反应的过程如下：混合10μl2mm焦磷酸和50μl无机焦磷酸酶，再加入86μl缓冲液，至少反应30min，然后加入铜盐，反应至少5min。

反应在25℃下进行。在25℃，焦磷酸酶工作活性最高。

所述缓冲液为hepesbuffer（n-2-羟乙基哌嗪-n’-2-乙磺酸溶液）。

所述铜盐为硫酸铜，铜盐也可以为其它可溶铜盐。

（1）本发明的有益效果如下：该方法使用了与生理条件相一致的天然底物ppi，这意味着该方法可以提供生理条件下ppase的实际活性水平。

（2）该方法简单易操作，无需标记，在均相溶液反应。

（3）该方法结合了黑磷纳米材料对铜离子的特异性吸附性质，发展一种新型传感器，实现对ppase的检测，操作简单，灵敏度高。

综上所述：本发明中黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术用于检测焦磷酸酶活性。该方法简单易操作，在均相溶液中操作，使用了与生理条件相一致的天然底物ppi并结合了黑磷纳米材料对铜离子的特异性吸附性质，可以实现对焦磷酸酶的灵敏检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为本发明黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术的原理图；

图2为本发明黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术用于特异性检测焦磷酸酶活性；

图3为本发明黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术用于检测焦磷酸酶活性，在不同的焦磷酸酶浓度下，电化学响应信号的变化；

图4为本发明黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术用于检测焦磷酸酶活性，电化学响应信号与焦磷酸酶浓度对数值的线性关系；

图5为本发明黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术用于检测焦磷酸酶的抑制剂，在焦磷酸酶浓度为10mu/ml时，随着抑制剂na3po4浓度的不断增大，电化学响应信号逐渐减弱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极（gce）的制备：将黑磷纳米片置于超声仪中超声2h，然后加10v电压，电解黑磷纳米片溶液30min，然后再置于超声仪中超声2h，目的是使黑磷纳米片进行剥离。然后，将黑磷溶液（6μg）滴在gce表面，置于干燥箱中，得到滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极。

实施例2

（1）含有不同种类酶反应液的准备：

10μl2mmppi和50μlppase（1.5μl1mu/μlppase和44.5μl水），86μlhepesbuffer，在25℃下水浴反应55min。

保证其他条件不变，将上述过程中50μlppase分别改为50μl（11.55μl1299mu/mlgox和38.45μl水）的葡萄糖氧化酶（gox），使得其最终浓度为100mu/ml和50μl(3.75μl4mu/μlcpgmtase，15μl10×nebuffer，0.75μl200×s-adenosylmethionine，30.5μl水)的cpg甲基转移酶（cpgmethyltransferase），使得其最终浓度为100mu/ml。其测得的数据分别对应图2中的gox和cpgmtase柱状图。

保证其他条件不变，将上述过程中50μlppase改为1.5μl1mu/ml的ppase，11.55μl1299mu/mlgox，3.75μl4mu/μlcpgmtase，15μl10×nebuffer，0.75μl200×s-adenosylmethionine，17.45μl水的混合液，使得ppase、gox和cpgmtase的浓度分别为10mu/ml，100mu/ml和100mu/ml。其测得的数据对应图2中的mix柱状图。

保证其他条件不变，将上述过程中50μlppase改为50μl的水，其测得的数据对应图2中的control柱状图。

（2）然后向上述溶液加8μl2mmcuso4，25℃水浴反应10min。取30μl反应液滴在实施例1得到的滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极表面，反应5h。用去离子水洗去反应液，用柔和的氮气吹干。

（3）将上述电极置于ph7.2hepesbuffer（含有50mmkno3）的溶液中测方波伏安法，电势窗口选择为-0.3v-0.2v，电位跃为4mv，振幅为25mv，频率为25hz，在56mv左右出现特征峰。

由图2可知，本发明中黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术可以用于特异性检测焦磷酸酶活性。

实施例3

（1）10μl2mmppi和50μlppase（不同浓度的酶液），再加入86μlhepesbuffer（n-2-羟乙基哌嗪-n’-2-乙磺酸），在25℃下水浴反应55min。

（2）然后向上述溶液加8μl2mmcuso4，25℃水浴反应10min。取30μl反应液滴在实施例1得到的滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极表面，反应5h。用去离子水洗去反应液，用柔和的氮气吹干。

（3）将上述电极置于ph7.2hepesbuffer（含有50mmkno3）的溶液中测方波伏安法，电势窗口选择为-0.3v-0.2v，电位跃为4mv，振幅为25mv，频率为25hz，在56mv左右出现特征峰。

测得的swav曲线随ppase浓度不同而变化的现象图，如图3所示。

电化学响应信号与ppase浓度的对数值的变化关系如图4所示，随着ppase浓度的增加，水解反应液中越来越多的ppi变为pi，测得铜离子的电化学响应信号增强。ppase浓度在0.01mu/ml到10mu/ml的浓度范围内变化时，电化学响应信号与ppase浓度的对数值之间有很好的线性关系，最低检测下限为0.01mu/ml。

实施例4

（1）含有ppase和抑制剂na3po4反应液的准备

10μl2mmppi和ppase（1.5μl1mu/μlppase，最终浓度为10mu/ml），再加入不同体积40mmna3po4（浓度分别为0、0.2mm、0.4mm、0.6mm、1mm、2mm、4mm），加入86μlhepesbuffer，分别在25℃下反应55min。

（2）然后向上述溶液加8μl2mmcuso4，25℃水浴反应10min。取30μl反应液滴在实施例1得到的滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极表面，反应5h。用去离子水洗去反应液，用柔和的氮气吹干。

（3）将上述电极置于ph7.2hepesbuffer（含有50mmkno3）的溶液中测方波伏安法，电势窗口选择为-0.3v-0.2v，电位跃为4mv，振幅为25mv，频率为25hz，在56mv左右出现特征峰。

由图5可知，随着焦磷酸酶抑制剂na3po4浓度的增大，铜离子的电化学响应信号逐渐减弱。因此，我们可以将黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术监测焦磷酸酶的抑制剂。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。