一种基于免疫组化染色技术检测和分析幽门螺杆菌的方法与流程

本发明涉及免疫组织化学技术领域，具体涉及一种免疫组化染色技术检测和分析幽门螺杆菌的方法。

背景技术：

幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性菌，主要分布在胃粘膜组织中，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。据统计，全世界人群中幽门螺杆菌的感染率达50％，我国的感染率高达60％-90％，幽门螺杆菌感染可导致慢性胃炎、胃溃疡、胃癌和和胃淋巴瘤等消化道疾病，而且随着时间的迁移，现在治疗幽门螺杆菌病越来越困难了，原来敏感性较强的抗生素一次性根治率可达90％多，如今使用同样的药物，根治率却往往下降到40％～60％，而且治疗时间越长，治愈的希望越小。本领域的专家意见均认为，已有耐药迹象的患者在治疗前，应先做耐药性试验，以便指导合适药物的选择。

然而在实践中发现，有许多幽门螺杆菌患者并未发生基因突变，却依然对抗生素耐药。对于这一类患者该如何检测和分析判定，目前本领域还没有合适的方法，无法提供个性化的治疗指导方案。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种检测和分析幽门螺杆菌的方法，可以用于幽门螺旋杆菌患者的耐药性的风险预判，从而为指导幽门螺杆感染患者的个性化治疗提供参考。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于免疫组化染色技术检测和分析幽门螺杆菌的方法，包括：

1)对幽门螺旋杆菌样本的组织切片进行免疫组化染色；

2)根据步骤1)的染色结果对幽门螺旋杆菌菌群进行形态判定；观察幽门螺旋杆菌菌群的形态，如果为球形或椭圆形球状菌群，则形态判定为非螺旋形；如果不是球形或椭圆形球状菌群，则形态判定为螺旋形。

在上述形态判定中：

a.螺旋形：包括卷曲的螺旋菌群，末端较细的直形杆状或成角形海鸥翅样，伴有球状末端的直形或成角形、短雪茄形；

b.非螺旋形：包括球形或椭圆形球状菌群，多数球形hp直径近似于螺旋形hp的1/2～1/3长。

有许多幽门螺杆菌患者并未发生基因突变，却依然对抗生素耐药。在对幽门螺旋杆菌样本的组织切片的病理观察中发现，可观察到幽门螺杆菌的形态发生了改变，幽门螺旋杆菌菌群的形态表现为非正常的球形或椭圆形球状菌群，即非螺旋形。通过观察幽门螺旋杆菌菌群的形态是否为非螺旋形(球形或椭圆形球状菌群)，可以辅助判断未发生基因突变的幽门螺杆菌患者的抗生素耐药，从而为个性化的治疗提供指导，以缩短治疗时间，提高治愈率。

为了更好的反映患者感染幽门螺杆菌的轻重程度，上述方法中进行形态判定时，还可以同时进行幽门螺杆菌阴/阳性判定。所述阴/阳性判定的方法为：

a.组织切片中见黄色或棕黄色着色的幽门螺旋杆菌菌体，则染色结果为阳性；这表示组织切片上存有幽门螺旋杆菌；阳性染色结果分别是：

a1.若组织切片中幽门螺杆菌散在分布无聚集状态，占组织比例<1/5区域判定为：阳性(+)；

a2.若组织切片中幽门螺杆菌散在分布并有少量聚集状态，占组织比例<1/5区域判定为：阳性(+—++)；

a3.若组织切片中菌体散在分布或有少量聚集状态，占组织比例1/5-3/5区域判定为：阳性(++)；

a4.若组织切片中菌体散在分布或有少量聚集状态，占组织比例>3/5区域判定为：阳性(++—+++)；

a5.若组织切片中菌体较多散在分布或菌体大量聚集呈簇状或片状分布，占组织比例>3/5区域判定为；阳性(+++)；

b.组织切片中未见黄色或棕黄色着色的幽门螺旋杆菌菌体，则染色结果为阴性；这表示组织切片上无幽门螺旋杆菌，判定为：阴性(-)。

通过上述对幽门螺旋杆菌菌群形态判定和阴/阳性判定的结合，可以直接观察患者感染幽门螺杆菌的轻重程度及该菌株存在于患者体内的形态，辅助临床医生为患者提供个性化的治疗指导。

要从免疫组化染色的组织切片中观察球形或椭圆形球状菌群(非螺旋形)，这对组织切片的质量和免疫组化染色的质量有很高的要求。如果组织切片和/或免疫组化染色的操作不到位，很容易导致观察不到非螺旋形或出现假阳性(即出现非球形或椭圆形球状菌群导致的球形或椭圆形染色斑点)。为了确保组织切片的免疫组化染色能够凸显出球形或椭圆形球状菌群(非螺旋形)，提升切片质量和观察的准确率，本发明还提供了一种免疫组化染色技术检测幽门螺杆菌的方法，包括步骤：a.幽门螺杆菌石蜡样本切片处理、b.脱蜡和水化、c.抗原修复、d.阻断内源性过氧化物酶、e.加一抗、f.加酶标聚合物、g.显色、h.复染、i.封片、j.阅片。

具体的，所述步骤a.幽门螺杆菌石蜡样本切片处理，是对幽门螺杆菌石蜡样本进行切片，组织切片厚度为3-5μm，之后在放入65-70℃恒温箱中加热2h～5h。具体的操作步骤可以为：

1)对幽门螺杆菌石蜡样本进行切片，组织切片厚度约为3-5μm，例如3μm、4μm或5μm，优选为4μm；

2)将切片黏附在防脱玻片上并除去组织切片中的水滴；

3)然后放入65-70℃恒温箱中加热2h～5h，取出冷却至室温；加热时间可以为2h，3h，4h，5h，优选为2h。

具体的，所述步骤b.脱蜡和水化，是将步骤a得到的石蜡切片先后用二甲苯、无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇浸泡，然后用水冲洗。其中，二甲苯浸泡三次，无水乙醇浸泡两次，95％乙醇和80％乙醇各浸泡1次。每次浸泡后需去除多余的液体后再进行下一次浸泡。具体的操作步骤可以为：

1)将处理好的石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡5-10分钟；优选为8分钟；

2)甩下玻片去除多余的液体后，切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡5-10分钟；优选为8分钟；

3)去除多余的液体后，切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡5-10分钟；优选为8分钟；

4)去除多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡3-5分钟；优选为3分钟；

5)去除多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡3-5分钟；优选为3分钟；

6)去除多余的液体后，切片置于95％乙醇中，浸泡3-5分钟；优选为3分钟；

7)去除多余的液体后，切片置于80％乙醇中，浸泡3-5分钟；优选为3分钟；

8)水冲洗约0.5～2分钟；优选为1分钟。

具体的，所述步骤c.抗原修复，是以ph＝9.0的edta水溶液为抗原修复液，将步骤b.脱蜡和水化得到的切片放入沸腾的抗原修复液中加热20分钟。具体的操作步骤可以为：

1)修复液配制：根据实验所需工作液的量，将edta浓缩液与蒸馏水按1:50加入不锈钢锅中，混匀(ph为9.0)；

2)将不锈钢锅放置于电磁炉上，大功率加热修复液至沸腾；

3)将功率调至最小(处于保温状态)，然后把切片置于耐高温染片架上(去除多余的水分)，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，继续加热20分钟；

4)将不锈钢锅离开热源，自然冷却10分钟；随后用自来水在不锈钢锅外壁冲淋加速锅内修复液冷却，待锅中修复液冷却至室温后取出切片并用自来水冲洗干净；

5)除去自来水(注意避免组织干片)，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈，pbs溶液冲洗3分钟×2次。

具体的，所述步骤d.阻断内源性过氧化物酶，是在步骤c.抗原修复得到切片上加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育一段时间。具体的操作步骤可以为：

1)用手甩干除去pbs溶液，切片上加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10分钟；

2)pbs溶液冲洗冲洗3次，每次3～5分钟；

3)加入非免疫动物血清(羊)100ul，孵育15分钟左右；

4)用手甩下切片，除去多余的血清。

具体的，所述步骤e.加一抗，是在步骤d.阻断内源性过氧化物酶得到的切片上加hp抗体，室温下孵育一段时间。具体的操作可以为：

1)除去pbs溶液，切片上加100μl的hp抗体(这里采用迈新公司生产的抗体)，室温下孵育60分钟；

2)pbs溶液冲洗3次，每次3～5分钟。

具体的，所述步骤f.加酶标聚合物，是在步骤e.加一抗得到的切片上加酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物，室温下孵育一段时间。具体的操作可以为：

1)除去pbs溶液，切片上加100μl酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物，室温下孵育15分钟；

2)pbs溶液冲洗3次，每次3～5分钟。

具体的，所述步骤g.显色，是将步骤f.加酶标聚合物得到的切片用dab显色液进行显色，室温下孵育3～5分钟。具体的操作可以为：

1)dab显色液配制：根据实验所需工作液的量，将kit-0014试剂盒(这里采用迈新公司生产的免疫组化染色试剂，编号kit-0014)中的试剂3a、试剂3b、试剂3c按20:1:1加入dab显色液配制管中，混匀；

2)除去pbs溶液，切片上加100～200μl配制的dab显色液，室温下孵育3～5分钟(一般不超过10分钟)，光学显微镜观察染色结果。

具体的，所述步骤h.复染，是将步骤g.显色得到的切片，用苏木素染色液孵育10～30秒。具体的操作可以为：

1)用水冲洗终止dab显色，切片上加100～200μl苏木素染色液孵育10～30秒(根据实验室自身情况做微调)，自来水冲洗终止苏木素染色液复染；

2)除去多余的水分，切片用pbs溶液返蓝(30-60秒)，然后自来水冲洗干净；

具体的，所述步骤i.封片，是将步骤h.复染得到的切片，先后用80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯浸泡，然后封片。其中，80％乙醇和95％乙醇各浸泡1次，无水乙醇浸泡两次，二甲苯浸泡两次。每次浸泡后需去除多余的液体后再进行下一次浸泡。具体的操作步骤可以为：：

1)除去多余的水分后，切片置于80％乙醇中，浸泡2分钟左右；

2)除去多余的液体后，切片置于95％乙醇中，浸泡2分钟左右；

3)除去多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡2分钟左右；

4)除去多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡2分钟左右；

5)除去多余的液体后，切片置于二甲苯中，浸泡2分钟左右；

6)除去多余的液体后，切片置于二甲苯中，浸泡2分钟左右；

7)切片用中性树胶和盖玻片封片。

具体的，所述步骤j.阅片，是指通过显微镜观察切片中菌体的染色情况。具体的操作可以包括对幽门螺旋杆菌菌群进行形态判定和/或进行阴/阳性判定。

采用上述步骤a～j的方法，所制备的切片能够清晰显示和凸显出球形或椭圆形球状菌群(非螺旋形)，可以提高切片的质量和合格率，提高观察的准确性，有效避免因切片质量不合格所导致的难以观察到球形或椭圆形球状菌群(非螺旋形)、或观察到假阳性等不良事件的发生。

本发明的方法具有以下优点：

1.通过免疫组化染色技术对幽门螺杆菌的组织切片进行染色，可以直观的观察到当前状态下幽门螺杆菌的存在形态，有助于临床医生给出个性化的治疗方案。本发明还可以进一步的结合轻重程度和存在形态，了解患者感染幽门螺杆菌的轻重程度，有助于临床医生给出合理的治疗方案。

2.本发明填补临床上非幽门螺杆菌基因突变而产生耐药的情况的判断方法的空白，通过菌株的形态判定，对出现幽门螺杆菌球形变而产生耐药的患者，可以给医生提供个性化指导。

3.本发明还提供了包含步骤a～j的检测幽门螺杆菌的方法，以提供能清晰显示和凸显出球形或椭圆形球状菌群(非螺旋形)的免疫组化染色的组织切片，可以提高切片的质量和观察的准确性。

附图说明

图1为实施例1中200x倍镜下的检测结果图。

图2为实施例1中1000x倍镜下的检测结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一组织切片的免疫组化染色及结果判断

1.石蜡样本切片处理：

1)对采集的幽门螺杆菌石蜡样本进行切片，组织切片厚度约为4μm；

2)将切片黏附在防脱玻片上并除去组织切片中的水滴；

3)将玻片放入65-70℃恒温箱中加热两个小时，取出冷却至室温。

2.脱蜡和水化：

1)将处理好的石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡8分钟；

2)甩下玻片去除多余的液体后，切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡8分钟；

3)去除多余的液体后，切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡8分钟；

4)去除多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡3分钟；

5)去除多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡3分钟；

6)去除多余的液体后，切片置于95％乙醇中，浸泡3分钟；

7)去除多余的液体后，切片置于80％乙醇中，浸泡3分钟；

8)自来水冲洗1分钟。

3.抗原修复：

1)修复液配制：根据实验所需工作液的量，将edta浓缩液与蒸馏水按1:50加入不锈钢锅中，混匀(ph为9.0)；

2)将不锈钢锅放置于电磁炉上，大功率加热修复液至沸腾；

3)将功率调至最小(处于保温状态)，然后把切片置于耐高温染片架上(去除多余的水分)，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，继续加热20分钟；

4)将不锈钢锅离开热源，自然冷却10分钟；随后用自来水在不锈钢锅外壁冲淋加速锅内修复液冷却，待锅中修复液冷却至室温后取出切片并用自来水冲洗干净；

5)除去自来水(注意避免组织干片)，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈，pbs溶液冲洗3分钟×2次。

4.阻断内源性过氧化物酶：

1)用手甩干除去pbs溶液，切片上加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10分钟；

2)pbs溶液冲洗3分钟×3次；

3)加入非免疫动物血清(羊)(这里采用迈新公司生产的羊血清)100ul，孵育15分钟左右；

4)用手甩下切片，除去多余的血清。

5.加一抗：

1)切片上加100μl的hp抗体(这里采用迈新公司生产的抗体)，室温下孵育60分钟；

2)pbs溶液冲洗3分钟×3次。

6.加酶标聚合物

1)除去pbs溶液，切片上加100μl酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物，室温下孵育15分钟；

2)pbs溶液冲洗3分钟×3次。

7.显色：

1)dab显色液配制：根据实验所需工作液的量，将kit-0014试剂盒(这里采用迈新公司生产的免疫组化染色试剂，编号kit-0014)中的试剂3a、试剂3b、试剂3c按20:1:1加入dab显色液配制管中，混匀；

2)除去pbs溶液，切片上加100～200μl配制的dab显色液，室温下孵育3～5分钟，光学显微镜观察染色结果。

8.复染：

1)自来水冲洗终止dab显色，切片上加100～200μl苏木素染色液孵育10～30秒，自来水冲洗终止苏木素染色液复染；

2)除去多余的水分，切片用pbs溶液返蓝(30-60秒)，然后自来水冲洗干净；

9.封片：

1)除去多余的水分后，切片置于80％乙醇中，浸泡2分钟；

2)除去多余的液体后，切片置于95％乙醇中，浸泡2分钟；

3)除去多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡2分钟；

4)除去多余的液体后，切片置于无水乙醇中，浸泡2分钟；

5)除去多余的液体后，切片置于二甲苯中，浸泡2分钟；

6)除去多余的液体后，切片置于二甲苯中，浸泡2分钟；

7)切片用中性树胶和盖玻片封片。

10.阅片：

通过显微镜观察切片中菌体的染色情况。

11.结果判断：

在组织阳性对照实验成立的基础上判读，若组织阳性对照实验为阴性结果，表明试剂失效或实验操作错误，应重新实验。

1)幽门螺杆菌阴/阳性判定：

a.组织切片中的幽门螺旋杆菌菌体见黄色或棕黄色着色则染色结果为阳性，表示组织切片上存有幽门螺旋杆菌：

a1.若组织切片中幽门螺杆菌散在分布无聚集状态，占组织比例<1/5区域判定为：阳性(+)；

a2.若组织切片中幽门螺杆菌散在分布并有少量聚集状态，占组织比例<1/5区域判定为：阳性(+—++)；

a3.若组织切片中菌体散在分布或有少量聚集状态，占组织比例1/5-3/5区域判定为：阳性(++)；

a4.若组织切片中菌体散在分布或有少量聚集状态，占组织比例>3/5区域判定为：阳性(++—+++)；

a5.若组织切片中菌体较多散在分布或菌体大量聚集呈簇状或片状分布，占组织比例>3/5区域判定为；阳性(+++)；

b.组织内未有任何幽门螺旋杆菌菌体见黄色或棕黄色着色则染色结果为阴性，表示组织切片上无幽门螺旋杆菌，判读为阴性(-)。

2)幽门螺杆菌形态判定：

a.螺旋形:包括卷曲的螺旋菌群，末端较细的直形杆状或成角形海鸥翅样，伴有球状末端的直形或成角形、短雪茄形；

b.非螺旋形:包括球形或椭圆形球状菌群，多数球形hp直径近似于螺旋形hp的1/2～1/3长。

幽门螺杆菌石蜡样本来源为郑州大学第五附属医院的冯女士，经临床医生判断为有耐药迹象。按本实施例的方法步骤对该样本进行检测和分析，胃幽门螺杆菌的免疫组化检测结果如图1-2所示。图1为200x倍镜的结果；图2为1000x倍镜的结果。由图1-2可判断，幽门螺杆菌形态判定为非螺旋形，1000x倍镜下可清楚的观察到呈球形或椭圆形球状菌群(图2中圆圈内所示)，其球形幽门螺杆菌的直径近似于螺旋形hp的1/2～1/3；幽门螺杆菌阴/阳性判定为阳性(+)，组织切片腺体中菌体散在分布无聚集状态，占组织比例<1/5区域。根据本发明提供的判定方法，该幽门螺杆菌石蜡样本中可观察到球形变。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。