本发明属于猪丁型冠状病毒技术领域，尤其涉及一种猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒。
背景技术：
猪的丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)最早发现于2012年，香港大学的woo等从死亡哺乳动物中检测到猪丁型冠状病毒。冠状病毒分为甲、乙、丙、丁四个亚群，感染猪的丁型冠状病毒(pdcov)是唯一一种感染非禽类的丁型冠状病毒。此后，在美国、中国、韩国等许多国家相继报道了pdcov的流行。与pedv和tgev类似，pdcov主要引起猪的肠道疾病，导致感染猪腹泻、呕吐和脱水，发病率和死亡率可高达50％-100％，尤以哺乳阶段仔猪发病最为严重，严重威胁着猪群健康，给养猪业带来了巨大的经济损失。
pdcov全长25.4kb，其基因组结构与一般冠状病毒(coronavirus,cov)相似，基因组结构从5’-3’末端依次为复制酶开放阅读框lab(replicaseorflab),s糖蛋白基因(spike,s)、小膜蛋白基因(envelope,e)、膜蛋白基因(membrane,m)以及核衣壳蛋白基因(nucleocapsid,n)，5’端和3’端都有较短的非翻译区。其中，n蛋白是病毒组成成分中最为丰富和多功能的蛋白。n蛋白是与基因组rna形成复合物的结构蛋白，在病毒体装配期间与病毒膜蛋白相互作用，并且在提高病毒转录和装配效率中，及在致病机理形成过程中起关键作用。
目前针对pdcov的诊断方法主要为rt-pcr方法，针对pdcov抗体的检测方法的研究较少。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测试剂盒，包括包被酶标板，包被酶标板以重组n蛋白作为包被抗原。
重组n蛋白由序列表seq.id.no.1的基因碱基序列编码或者具有seq.id.no.2的氨基酸序列。
上述elisa检测试剂盒，还包括阴性血清、阳性血清、hrp标记的山羊抗猪igg抗体、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液；洗涤液为pbs+0.05％tween-20；稀释液为pbs+2％脱脂奶粉+0.05％tween-20；包被液为采用0.05mph9.6na2co3-nahco3缓冲液；底物液为单组份tmb底物显色液；封闭液为pbs+5％脱脂奶粉；终止液为2mh2so4溶液。
猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法，按以下操作进行：
包被抗原：将重组n蛋白以包被液稀释后加入酶标板中包被，100μl/孔，得包被酶标板；
洗涤：弃去包被液并用洗涤液洗洗涤；
封闭：每孔加入250μl封闭液，37℃封闭，弃去封闭液洗涤；
孵育一抗：将猪血清与稀释液混匀，100μl/孔，37℃孵育，弃去并洗涤；
孵育二抗：将hrp标记的山羊抗猪igg抗体与稀释液混匀，100μl/孔，37℃孵育，弃去并洗涤；
显色读数：以100μl/孔加入底物液，室温显色反应后加入终止液，酶标仪读取od450值。
重组n蛋白以包被液稀释至2μg/ml，hrp标记的山羊抗猪igg抗体的稀释度为1:4000。
包被为4℃包被过夜。
封闭时间为为120分钟。
猪血清的稀释度为1:80，孵育时间为60min。
孵育二抗的反应时间为30分钟。
显色反应时间为10分钟。
针对猪丁型冠状病毒(pdcov)抗体检测技术较为欠缺的问题，发明人结合n蛋白是病毒组成成分中最为丰富和多功能的蛋白，设计了一种猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测试剂盒，包括包被酶标板，包被酶标板以重组n蛋白作为包被抗原。据此，还建立相应elisa检测方法，为检测pdcov提供了一种有实际价值的诊断工具。应用本发明可建立识别猪丁型冠状病毒感染产生的抗体的方法，具有较高的特异性与敏感性，该法操作简单，耗时短，成本低，可大批量检测，对该病的防控与净化具有重要意义。
具体实施方式
猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法的建立
1.材料、试剂与仪器
1.1主要试剂
pbs粉剂：博士德公司产品；
脱脂奶粉：solarbio公司产品；
hrp标记山羊抗猪igg抗体：美国earthox公司产品；
单组份tmb底物显色液：天根公司产品；
96孔酶标板：constar公司产品；
重组n蛋白：自制(由序列表seq.id.no.1的基因碱基序列编码,具有seq.id.no.2的氨基酸序列)。
1.2主要仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进)、紫外线分光光度计(天普)、酶标仪(伯乐)等。
1.3间接elisa相关试剂的配制
1)包被液：采用0.05mph9.6na2co3-nahco3缓冲液，称取na2co30.159g，nahco30.293g，加灭菌ddh2o至100ml，4℃储存；
2)血清及酶标抗体稀释液：pbs+2％脱脂奶粉+0.05％tween-20；
3)洗涤液：pbs+0.05％tween-20；
4)封闭液：pbs+5％脱脂奶粉；
5)底物液：单组份tmb底物显色液；
6)终止液：2mh2so4溶液。在80ml的水中缓缓加入11.1ml的浓硫酸，定容至100ml。
2.方法、步骤与结果
2.1间接elisa的优化
2.1.1重组蛋白最佳包被浓度与二抗最佳工作浓度的优化
用包被液将重组n蛋白依次稀释至16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml7个稀释度，每个稀释度包被elisa板的1个竖行，包被两块。用抗体稀释液将hrp标记的山羊抗猪igg抗体依次进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000和1:32000倍比稀释，每个稀释度加在同一个横行，100μl/孔，形成方阵。选择阳性血清od450值与阴性血清od450值的比值(p/n值)最大的抗原浓度和二抗稀释度作为最佳抗原包被浓度及最佳二抗反应浓度。结果表明抗原包被浓度为2μg/ml，酶标二抗浓度为1:4000时，p/n值最大(表1)。
表1最佳抗原包被浓度和最佳二抗稀释倍数的优化
2.1.2抗原包被条件的确定
以2.1.1中得到的最适抗原包被浓度包被酶标板，100μl/孔；实验分成三个组，第一组以4℃包被过夜；第二组4℃包被过夜加37℃湿盒包被2h；第三组37℃湿盒包被2h。每组设3个重复，分别进行elisa，酶标仪测定阴阳性血清的od450值，计算出p/n值。选取p/n值大的作为最佳抗原包被条件。结果表明4℃包被过夜为最佳包被条件，此时p/n值最大(表2)。
表2最佳包被条件的优化
2.1.3最佳封闭时间的确定
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，100μl/孔。将酶标板分成四组。第一组37℃封闭30min，第二组37℃封闭60min，第三组37℃封闭90min，第四组37℃封闭120min。洗涤后进行elisa反应。分别测定各组的阴阳性血清od450值，并计算出p/n值，确定最佳封闭时间。结果表明37℃封闭120min为最佳封闭条件，此时p/n值最大(表3)。
表3最佳封闭时间的确定
2.1.5最佳血清稀释度及血清孵育时间的确定
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，100μl/孔。封闭后分成三组。第一组从上到下分别加入1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释的阴阳性血清，各两个重复，37℃反应30min；第二组从上到下分别加入1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释的阴阳性血清，各两个重复，37℃反应60min；第三组上到下分别加入1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释的阴阳性血清，各两个重复，37℃反应120min。分别进行elisa反应，反应结束后分别测定各组各个稀释度的阴阳性血清平均od450值，并计算出p/n值，从而确定最佳血清稀释度和最佳血清反应时间。结果表明，血清以1:80倍稀释，孵育60min时，p/n值最大(表4)。
表4最佳血清稀释倍数和作用时间的优化
2.1.6最佳二抗反应时间的确定
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，100μl/孔。洗涤后37℃封闭2h，加入1:80稀释的阴阳性血清，100μl/孔，37℃反应1h。洗涤后加入1:4000倍稀释的hrp-山羊抗猪igg抗体，100μl/孔。再分成四组，第一组37℃反应15min，第二组37℃反应30min，第三组37℃反应45min，第四组37℃反应60min，每组3个重复。洗涤后显色，在酶标仪上测定各组阴阳性血清的od450值，并计算出p/n值，以确定二抗最佳反应时间。结果表明，二抗反应时间为30min时，p/n值最大(表5)。
表5最佳二抗反应时间的优化
2.1.7底物显色时间的确定
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，100μl/孔。洗涤后37℃封闭2h，加入1:80稀释的阴阳性血清，100μl/孔，37℃反应1h。洗涤后加入1:4000倍稀释的hrp-山羊抗猪igg抗体，100μl/孔，37℃反应30min。洗涤后分成四组。第一组加入100μl/孔底物溶液，室温显色5min，第二组加入100μl/孔底物溶液，室温显色10min；第三组加入100μl/孔底物溶液，室温显色15min；第四组加入100μl/孔底物溶液，室温显色20min。每组3个重复，显色完成后加入50μl/孔的终止液终止显色，分别测量每组的阴阳性血清的od450值，并计算出p/n值，以确定最佳底物显色时间。结果表明，显色10min时，p/n值最大(表6)。
表6最佳底物显色时间的优化
2.1.8优化好的间接elisa检测方法
综上研究结果，猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法，按以下操作进行：
包被抗原：将重组n蛋白以包被液稀释至2μg/ml加入酶标板中4℃包被过夜，100μl/孔，得包被酶标板；
洗涤：弃去包被液并用洗涤液洗洗涤；
封闭：每孔加入250μl封闭液，37℃封闭120分钟，弃去封闭液洗涤；
孵育一抗：按稀释度为1:80，将猪血清与稀释液混匀，100μl/孔，37℃孵育60min，弃去并洗涤；
孵育二抗：按稀释度为1:4000，将hrp标记的山羊抗猪igg抗体与稀释液混匀，100μl/孔，37℃孵育30分钟，弃去并洗涤；
显色读数：以100μl/孔加入底物液，室温显色反应10分钟后加入终止液，酶标仪读取od450值。
hrp标记的山羊抗猪igg抗体的稀释度为1:4000。
2.2间接elisa阴阳性临界值
随机选取新鲜猪血清若干份，通过western-blot分析，获得30份不能与重组n蛋白发生特异性结合的猪血清，利用已建立并优化好的间接elisa进行检测，读出每份血清的od450值，计算s/p值。s/p值＝(样品血清od450值-阴性血清od450值)/(阳性血清od450值-阴性血清od450值)。计算30份血清s/p值的平均值及标准方差(sd)。当
经计算30份阴性血清s/p值的平均值x＝0.119，标准方差sd＝0.027，因此计算得x+3sd＝0.200，x+2sd＝0.173。因此当待检血清样品s/p值>0.200时判定为阳性；待检血清样品s/p值<0.173时判定为阴性；当0.173≤待检血清样品s/p值≤0.200时判定为可疑。
2.3特异性试验
用纯化好的重组蛋白pdcovn蛋白包被酶标孔，按照前面建立并优化的elsia方法，检测猪瘟病毒标准阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒标准阳性血清、猪圆环病毒标准阳性血清、猪口蹄疫病毒标准阳性血清、猪伪狂犬病毒标准阳性血清和猪流行性腹泻病毒标准阳性血清，同时设pdcov阴阳性血清对照，以判定本实验建立的pdcovn蛋白抗体间接elisa检测方法是否与其它病原的抗体有交叉反应。结果显示，猪瘟病毒标准阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒标准阳性血清、猪圆环病毒标准阳性血清、口蹄疫病毒标准阳性血清、猪伪狂犬病毒标准阳性血清、流行性腹泻病毒标准阳性血清的s/p值均小于0.173(表7)，因此说明本研究建立的pdcov-n蛋白抗体间接elisa具有良好的特异性。
表7pdcovn蛋白抗体间接elisa特异性试验结果
2.4重复性试验
在第1、3、5天分别包被三个批次的pdcovn蛋白，并在第6天对阴阳性血清进行elisa检测，批次内设4个重复，测定od450值，计算出平均值、标准差和变异系数。
2.4.1批内重复性：计算出各个批次内4个重复间的变异系数，根据变异系数的大小来确定批内的重复性。批内阳性血清的od450值变异系数在0.8％-4.7％之间，阴性血清od450值变异系数在3.6％-4.8％之间(表8)。
3.4.2批间重复性试验
2.4.2批间重复性：计算出三个批次间的变异系数，并根据变异系数大小来确定批间的重复性。批间阳性血清的od450值变异系数为3.9％，阴性血清的od450值变异系数为3.8％(表3-12)。
表8pdcovn间接elisa重复性试验结果
批内及批间试验的结果表明，本研究建立的elisa检测方法具有较好的重复性。
2.5敏感性试验
将3份pdcov阳性血清从1:40开始进行倍比稀释，利用建立好的elisa试剂盒进行检测，并设阴阳性对照。测定od450值，计算出s/p值，分析其敏感性。结果：本次试验阴阳性对照的od450值分别为0.126和0.985，分别计算3份阳性血清在各稀释度下的s/p值。结果表明3份阳性血清均在1:640时变为阴性，说明该试剂盒具有较好的敏感性，结果见表9。
表9pdcovn间接elisa敏感性试验结果
2.6pdcovn间接elisa检测方法的初步应用
利用本研究建立好的pdcovn蛋白间接elisa检测广西地区不同阶段猪群血清样品共计228份，计算出阳性率，分析广西部分地区各阶段猪群pdcov抗体水平。结果见表。从检测的结果看，总体样品阳性率为40.4％，不同阶段阳性率相差较大。其中后备母猪阳性最高为100％，保育猪阳性率最低为3.9％。公猪和母猪的阳性率也较高，分别为82.4％和60.5％。表明广西地区pdcov的感染情况也较为普遍。
表10临床血清pdcov抗体检测结果
序列表
<110>广西壮族自治区兽医研究所
<120>猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1029
<212>dna
<213>猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoro-navirus)
<400>1
atggctgcaccagtagtccctactactgacgcgtcttggtttcaggtgctcaaagctcaa60
aacaaaaaggctactcatcctcagtttcgtggcaatggagttccgcttaactccgccatc120
aaacccgttgaaaaccatggttactggcttcgttacaccagacaaaagccgggtggtact180
ccgattcctccatcctatgccttttattatactggcacaggtcctagaggaaatcttaag240
tatggtgaactccctcctaatgataccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggt300
tcgggagctgacacttctattaaacctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaa360
catcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagcccaaggtttcagagtt420
gaccccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatct480
gttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgaccaatctgcacccgctgcg540
gtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatt600
tctcaggtatttggcaaccggtctcgcactggtgccaatgtcggctctgcagacactgag660
aagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctttagccagacatgtgcctggtgttcag720
gaaatgcttttcgctggccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttacc780
ttctcttactcaatcacagtgaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcg840
ctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaactaactaaggacaagaag900
cctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacctaaaaaggtaact960
ctgccagcagacaaacaggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatca1020
gcagcgtag1029
<210>2
<211>342
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
metalaalaprovalvalprothrthraspalasertrppheglnval
151015
leulysalaglnasnlyslysalathrhisproglnpheargglyasn
202530
glyvalproleuasnseralailelysprovalgluasnhisglytyr
354045
trpleuargtyrthrargglnlysproglyglythrproilepropro
505560
sertyralaphetyrtyrthrglythrglyproargglyasnleulys
65707580
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859095
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100105110
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130135140
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145150155160
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165170175
alaproalaalavalargarglysthrglnhisglnalaprolysarg
180185190
thrleuprolysglylysthrileserglnvalpheglyasnargser
195200205
argthrglyalaasnvalglyseralaaspthrglulysthrglymet
210215220
alaaspproargilemetalaleualaarghisvalproglyvalgln
225230235240
glumetleuphealaglyhisleugluserasnpheglnalaglyala
245250255
ilethrleuthrphesertyrserilethrvallysgluglyserpro
260265270
asptyrgluargleulysaspalaleuasnthrvalvalasnglnthr
275280285
tyrgluproprothrlysleuthrlysasplyslysproasplysgln
290295300
aspglnseralalysprolysglnglnlyslysprolyslysvalthr
305310315320
leuproalaasplysglnasptrpglutrpaspaspalaphegluile
325330335
lysglngluseralaala
340