一种高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白A测定试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒。

背景技术：

血清淀粉样蛋白a(serumsmyloida，saa)为载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，是一种急性时相反应蛋白，相对分子量约12kd，功能与高密度脂蛋白中第三成分(hdl3)相关，巨噬细胞对hdl-saa结合物的亲和力是对单独hdl亲和力的2-3倍。saa有4种亚型，其中saa1、saa2是急性蛋白，在炎症的急性反应期迅速上升；saa3基因在人类中不能表达；saa4能够持续表达，但不参与急性炎症反应。saa根据在体内表达情况，分为急性期saa(acutesaa，a-saa)和组成型saa(constitutivesaa，c-saa)。正常人体内saa主要来源于肝细胞组成型表达的c-saa，当机体受到感染、炎症、损伤等刺激后产生一系列细胞因子，在细胞因子的调控下a-saa水平迅速升高，成为此时体内主要的saa。a-saa的合成主要受il-1和tnf-α的调节，单独的il-6对于a-saa的合成影响不大。肝内合成的saa释放入血以后迅速与高密度脂蛋白(hdl)结合，并通过血清、细胞表面及细胞内的蛋白酶在肝脏降解。在肝脏中，il-6与il-1、tnf-α协同刺激激活的巨噬细胞和纤维母细胞大量合成a-saa。肝外细胞产生的saa则通过细胞间的黏附及内吞作用经蛋白酶降解。正常人血清中saa含量<10mg/l，急性期反应时，血浆saa浓度随机体炎症反应的发展可在5-6小时内迅速上升100-1000倍。另外，saa半衰期只有50分钟，当机体炎症反应控制后，saa又迅速降至正常水平。故saa可作为一种敏感的急性期炎症标志物。

目前，用于saa检测的主要有层析法(胶体金、荧光微球)和胶乳比浊法。层析法试剂系统变异较大，定量不够准确，灵敏度不够；胶乳比浊法试剂可在生化仪上实现全自动模式操作，系统误差小，精密度好，试剂稳定性好，但现有试剂的检测灵敏度不够好、线性范围不够宽。

为方便临床检测，有必要研制一种能同时检测血清和血浆样本中saa含量的高灵敏度、宽检测范围的试剂盒。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒。本发明提供的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒10min内即可完成单样本的检测，精密度、准确度、线性和抗干扰等各项指标都表现优异，能很好地诊断感染性疾病的早期炎症，既能检测血清中saa含量，又能检测血浆中saa含量，非常适用于临床上的生化分析仪，极大地方便了临床检验。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，包括试剂1、试剂2和不同浓度梯度的saa校准品；其中，试剂2包括只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球和只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球，所述只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径＞只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为150-300nm，终浓度为0.005％-0.1％(w/v)(该终浓度指的是不包括抗体的羧基胶乳微球本身的终浓度)；只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为60-140nm，终浓度为0.1％-0.4％(w/v)(该终浓度指的是不包括抗体的羧基胶乳微球本身的终浓度)；标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.003％-0.015％(w/v)；标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.025％-0.085％(w/v)。所述终浓度指的是各组分在试剂2中的终浓度。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为240nm，其终浓度为0.02％(w/v)；只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为123nm，其终浓度为0.2％(w/v)；标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.0065％(w/v)；标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.04％(w/v)；

或只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为273nm，其终浓度为0.01％(w/v)；只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为70nm，其终浓度为0.3％(w/v)；标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.005％(w/v)；标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.065％(w/v)；

或只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为223nm，其终浓度为0.015％(w/v)；只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为83nm，其终浓度为0.25％(w/v)；标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.0072％(w/v)；标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.055％(w/v)；

或只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为240nm，其终浓度为0.015％(w/v)；只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球的平均粒径大小为70nm，其终浓度为0.3％(w/v)；标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.006％(w/v)；标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.075％(w/v)。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球和只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球质量比为0.03-0.4:1。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂1中包括增敏剂；可选地，所述增敏剂包括：葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚蔗糖400或多聚赖氨酸中的至少一种；进一步可选地，葡聚糖分子量(mw)包括5000、25000、40000、80000、250000、500000、2000000中的至少一种；聚乙烯吡咯烷酮的分子量(mw)包括8000、10000、24000、58000中的至少一种；多聚赖氨酸分子量(mw)包括2000或5000中的至少一种。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂1中包括促凝剂；可选地，所述促凝剂包括peg(聚乙二醇)6000、peg8000或peg20000中的至少一种。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂2还包括稳定剂；可选地，所述稳定剂包含蛋白质、peg或糖中的至少一种；进一步可选地，所述蛋白质包括bsa(牛血清白蛋白)、明胶或酪蛋白中的至少一种；所述糖包括蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的至少一种。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，校准品为不同梯度浓度的人saa；可选地，人saa浓度梯度为：0.00，15.00，40.00，120.00，250.00，500.00mg/l。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，校准品的基质液包括下述组分：磷酸盐缓冲液，edta(乙二胺四乙酸)二钠或edta二钾，枸橼酸钠，肝素钠或肝素锂，海藻糖，bsa，氯化钠，氯化钾；可选地，校准品的基质液包括下述终浓度的组分：10-50mm的磷酸盐缓冲液(ph7.2-7.4)，2-10mm的edta二钠或edta二钾、1％-5％(w/v)的枸橼酸钠、0.02％-0.2％(w/v)的肝素钠或肝素锂、1％-5％(w/v)的海藻糖、0.2％-1％(w/v)的甘露醇、0.1％-2％(w/v)的bsa、100-300mm的氯化钠、50-150mm的氯化钾。即本发明提供的校准品基质液中含有一定量的肝素钠、肝素锂、edta二钠、edta二钾、枸橼酸钠等抗凝剂、稳定剂和无机盐等。适用于测定人血清和血浆中的saa含量。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂2包括下述组分：只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球、只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球、缓冲液、表面活性剂、无机盐和防腐剂。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂2包括下述终浓度的组分：0.005％-0.1％(w/v)只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为150-300nm)、0.003％-0.015％的标记的人saa单克隆抗体、0.1％-0.4％(w/v)只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为60-140nm)、0.025％-0.085％的标记的人saa多克隆抗体、0.2％-5％(w/v)的稳定剂、10-100mm的缓冲液、0.05％-0.3％(w/v)的表面活性剂、50-600mm的无机盐和0.05％-0.1％(w/v)的防腐剂。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂1包括下述组分：缓冲液、bsa、表面活性剂、edta、无机盐和防腐剂；可选地，试剂1中包括下述终浓度的组分：10-100mm的缓冲液、1.0％-10％(w/v)的促凝剂、0.2％-8％(w/v)的增敏剂、0.5％-5％(w/v)的bsa、0.05％-0.3％(w/v)的表面活性剂、1-10mm的edta、50-600mm的无机盐和0.05％-0.1％(w/v)的防腐剂。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂1或试剂2中的缓冲液相互独立地包括：ph值为5.0-9.0的mes缓冲液、磷酸盐缓冲液、mops缓冲液、taps缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris-cl缓冲液和hepes缓冲液中的至少一种。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂1或试剂2中的表面活性剂相互独立地包括：tween-20、tween-80或tritonx-100中的至少一种。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂1或试剂2中的防腐剂相互独立地包括：proclin300、硫柳汞钠、苯甲酸钠、krovin300或krovin500中的至少一种。防腐剂可防止试剂受到微生物污染。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，所述人saa单克隆抗体为源于小鼠的特异性单抗；所述人saa多克隆抗体为源于兔或羊的特异性多抗。人saa单克隆抗体的纯度≥95％，效价≥1:100000；人saa多克隆抗体的纯度≥95％，效价≥1:10000。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，所述羧基胶乳微球为聚苯乙烯羧基胶乳微球。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒在一种可能的实现方式中，所述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒用于血清和血浆的检测。

本发明实施例还提供了一种人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：使用上述配方制备人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，包括下述步骤：

制备试剂1：在合适离子强度的缓冲液中加入增敏剂、促凝剂、bsa、表面活性剂、edta、无机盐、防腐剂，充分混匀配制；

制备试剂2：分别用平均粒径为150-300nm的羧基胶乳微球标记人saa的单克隆抗体、用平均粒径为60-140nm的羧基胶乳微球标记人saa的多克隆抗体，再加入包含合适浓度的缓冲液、无机盐、稳定剂、表面活性剂和防腐剂；其中，只标记人saa的单克隆抗体的羧基胶乳微球和只标记人saa的多克隆抗体的羧基胶乳微球在试剂2体系中的浓度分别为0.005％-0.1％(w/v)和0.1％-0.4％(w/v)，标记的人saa单克隆抗体、多克隆抗体的终浓度分别为0.003％-0.015％(w/v)和0.025％-0.085％(w/v)；

制备校准品：用配制的基质液将人saa稀释，溯源后赋值得到系列浓度梯度的校准品。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，试剂2的制备步骤包括：用活化液稀释相应粒径的羧基胶乳微球至其质量浓度为0.5％-3％，加入质量浓度为0.01％-0.1％的活化剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，室温搅拌，活化羧基；活化结束后，离心、洗涤除去多余的edc；再加入标记缓冲液，超声将胶乳微球分散，分别加入saa单克隆抗体、saa多克隆抗体单独标记，室温搅拌，再加入终止液继续搅拌；将最终的反应液离心、洗涤，用保存液分别重悬标好的胶乳微球，将标记单抗的较大粒径微球与标记多抗的较小粒径微球按比例混合得试剂2；

其中，试剂2中，标单抗的羧基胶乳微球和标多抗的羧基胶乳微球质量比为0.03-0.4:1。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述活化液包括：ph值为4.0-6.0的0.01-0.2m的mes缓冲液、磷酸盐缓冲液或hepes缓缓冲液中的至少一种。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述标记缓冲液包括ph值为7.0-8.4的0.01-0.2m的磷酸盐缓冲液、mops缓冲液、taps缓冲液、硼酸盐缓冲液或tris-cl缓冲液中的至少一种。

本发明实施例还提供了上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的使用方法，包括下述步骤：主波长为570nm，加入2μl样本、150μl试剂1后，37℃水浴5min，再加入50μl试剂2，30s后读取吸光度a1，再反应4min后读取吸光度a2，计算两者吸光度的差值⊿a＝a2-a1；用上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒配套的6个校准品先进行多点定标(spline或logit-log(4p)拟合模型)；样本的浓度(单位为mg/l)可通过其检测时的吸光度变化在定标曲线上计算得到。

有益效果

1、目前市面上绝大多数胶乳试剂是只采用一种粒径的胶乳微球单独标记相应的兔多抗、羊多抗或配对的鼠单抗，不能很好地兼顾试剂的灵敏度和检测高值。而本发明实施例提供的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒同时使用多抗、单抗，二者分开标记，且单抗标记较大粒径微球以保证试剂盒的灵敏度，多抗标记较小粒径微球以保证试剂在高值区有更宽的检测范围。

本发明主要是利用抗原与抗体的特异性反应、借助不同粒径的羧基胶乳微球在反应空间(比色杯等)中凝聚成较大复合物(阻挡光线通过)，使反应液浊度增加来测定样本中saa的浓度。将人saa单抗、saa多抗分别标记到不同粒径的羧基胶乳微球上，当待测样本中的人saa与试剂中的抗体发生特异性反应，产生网格状的较大抗原-抗体复合物后，会使反应液中的浊度增加。在一定浓度范围内，反应液的浊度增加与抗原-抗体复合物的量成正比，即与样本中saa的浓度成正比。在配套的校准体系、合适的拟合模型下做出试剂的校准曲线，通过测定样本的光强变化可换算出待测saa的浓度。

2、以150-300nm平均粒径的微球标记saa单抗，搭配60-140nm的平均粒径微球标记saa多抗，可进一步提高本发明试剂盒的灵敏度和线性范围。粒径过小的微球不能很好地放大免疫反应的信号；而粒径过大，微球则会因重力作用在长期储存后发生沉降，影响测定结果。

3、微球分别标记saa单抗、saa多抗，通过调整二者浓度和比例，可使单抗、多抗的标记效率各自实现最佳状态，以实现在宽检测范围内有较好的免疫学反应放大信号，从而能很好地兼顾试剂的灵敏度和检测范围。与待测样本反应时，偶联的抗体可与样本中的人saa特异性结合，借助saa自身多样的抗原决定簇和试剂2中特异性抗体的丰富性，可在反应体系中产生占据较大空间的、多重抗原-抗体复合物，合适的反应位点散布更有利于免疫复合物在反应液中产生浊度变化，有效地提高了试剂的灵敏度(功能灵敏度可以达到0.20mg/l)，并可在saa为0.00-500.00mg/l的宽浓度范围内保持很好的线性，扩大了试剂盒的检测范围。

4、试剂1中缓冲液、促凝剂、增敏剂等可为免疫反应提供合适的反应条件、在一定程度上控制反应速度、提高试剂的灵敏度，尤其是试剂1中的促凝剂和增敏剂利用其自身的不同大分子量优势可在局部空间内更好地提高抗原抗体的结合效率和结合稳定性，有利于提高试剂的灵敏度；校准品基质液中加入的抗凝剂(肝素钠、肝素锂、edta二钠、edta二钾、枸橼酸钠等)有利于血浆样本的检测，在一定程度上扩大了该试剂适宜检测的样本类型。

5、本发明实施例中提供的高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，所用的聚苯乙烯胶乳微球为羧基修饰，其活化后可与抗体氨基形成共价的肽键，抗体可牢固地结合于胶乳微球表面；试剂2中合适的缓冲体系及稳定剂等则更进一步保证了人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的稳定性。

6、本发明实施例中提供的高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，10min内即可完成单样本的检测，具有灵敏度高(可达0.20mg/l)、检测范围宽(在saa为0.00-500.00mg/l的梯度浓度范围内保持良好的线性，线性相关系数r≥0.9900)、精密度好、准确度好和抗干扰能力强等特点，可在同一套校准体系下测定血清和血浆样本中saa浓度，应用于临床能很好地诊断感染性疾病的早期炎症。本发明实施例中提供的高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，反应后不产生沉淀、不发生附着，适用于临床生化分析仪，便于生化分析仪清洗。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1a是本发明实施例1的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的定标曲线及其线性分析结果。

图1b是本发明实施例2的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的定标曲线及其线性分析结果。

图1c是本发明实施例3的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的定标曲线及其线性分析结果。

图1d是本发明实施例4的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的定标曲线及其线性分析结果。

图2是本发明实施例4的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒与对照试剂同时检测临床40例血清样本的相关性。

图3是本发明实施例4的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒与对照试剂同时检测临床40例肝素抗凝血浆样本的相关性。

图4是本发明实施例4的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒同时检测40例临床血清及其对应的edta抗凝血浆样本的相关性。

图5是本发明实施例4的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒同时检测40例临床血清及其对应的枸橼酸钠抗凝血浆样本的相关性。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

实施例1-4中使用的人saa单克隆抗体购自medixbiochemica(其纯度≥95％，效价≥1:100000)，多克隆抗体购自北京阿匹斯生物技术有限公司(其纯度≥95％，效价≥1:10000)，聚苯乙烯羧基胶乳微球购自日本jsr。

实施例1

一种人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，包括试剂1、试剂2和不同浓度梯度的saa校准品；其中，

试剂1包括下述终浓度的组分：20mmhepes缓冲液(ph7.2)，0.5％(w/v)的bsa，3％(w/v)的peg6000，1％(w/v)的mw为40000的葡聚糖，150mm的kcl，0.05％(w/v)的tween-20，0.1％(w/v)的proclin300，2mm的edta；

试剂2包括下述终浓度的组分：只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为240nm，微球终浓度为0.02％(w/v))、0.0065％(w/v)的标记的人saa单克隆抗体、只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为123nm，微球终浓度为0.2％(w/v))、0.04％(w/v)的标记的人saa多克隆抗体、50mmmops缓冲液(ph7.4)、100mm氯化钾、0.3％(w/v)明胶、1％(w/v)bsa、2％(w/v)蔗糖、0.2％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)tritonx-100、0.1％(w/v)的proclin300；

校准品：含0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l六个浓度梯度的人saa，其基质液包括下述终浓度的组分：30mm的磷酸盐缓冲液(ph7.2)、2mm的edta二钠、1.5％(w/v)的枸橼酸钠、0.5％(w/v)的肝素锂、1％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)甘露醇、1％(w/v)bsa、150mm氯化钠、50mm氯化钾。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

制备试剂1：向20mmhepes缓冲液(ph7.2)中加入终浓度为0.5％(w/v)的bsa、终浓度为3％(w/v)的peg6000、终浓度为1％(w/v)的葡聚糖40000、终浓度为150mm的kcl、终浓度为0.05％(w/v)的tween-20、终浓度为0.1％(w/v)的proclin300、终浓度为2mm的edta，用0.22μm滤膜过滤后得试剂1；

制备试剂2：用50mmmes缓冲液(ph5.0)稀释相应粒径的羧基胶乳微球(240nm、-cooh量0.11-0.16mmol/g；123nm、-cooh量0.15-0.22mmol/g)至其质量浓度为1％，分别加入质量浓度为0.02％、0.05％的活化剂edc，在室温搅拌20min活化羧基；活化结束后，15000g离心、洗涤除去多余的edc；再加入标记缓冲液(50mmpbs，ph7.4)，超声将胶乳微球分散，分别加入saa单克隆抗体(标240nm微球)、saa多克隆抗体(标123nm微球)单独标记，室温搅拌1h，再加入终止液继续搅拌10min；将最终的反应液以15000g离心，用50mmpbs缓冲液(ph7.4)洗涤1次，用相应体积的保存液分别重悬标好胶乳(240nm微球终浓度为0.02％(w/v)、123nm微球终浓度为0.2％(w/v)，标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.0065％(w/v)，标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.04％(w/v))，搅拌混匀，保存液的组分为：50mmmops缓冲液(ph7.4)、100mm氯化钾、0.3％(w/v)明胶、1％(w/v)bsa、2％(w/v)蔗糖、0.2％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)tritonx-100、0.1％(w/v)的proclin300，得试剂2；

制备校准品：用上述成分的校准品基质液将体外表达的saa做稀释，进行溯源后赋值得到系列浓度的校准品(saa的系列浓度为0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l)。

实施例2

一种人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，包括试剂1、试剂2和不同浓度梯度的saa校准品；其中，

试剂1包括下述终浓度的组分：50mmmops缓冲液(ph7.4)，1.5％(w/v)的bsa，2％(w/v)的peg8000，5％(w/v)的mw为5000的多聚赖氨酸，300mm的nacl，0.05％(w/v)的tween-80，0.1％(w/v)的proclin300，2mm的edta；

试剂2包括下述终浓度的组分：只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为273nm，微球终浓度为0.01％(w/v))、0.005％(w/v)的标记的人saa单克隆抗体、只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为70nm，微球终浓度为0.3％(w/v))、0.065％(w/v)的标记的人saa多克隆抗体、50mmhepes缓冲液(ph7.2)、100mm氯化胺、0.2％(w/v)明胶、0.5％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、0.5％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)tritonx-100、0.1％(w/v)的proclin300；

校准品：含0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l六个浓度梯度的人saa，其基质液包括下述终浓度的组分：50mm的磷酸盐缓冲液(ph7.4)、5mm的edta二钠、2％(w/v)的枸橼酸钠、0.3％(w/v)的肝素锂、1.5％(w/v)海藻糖、0.3％(w/v)甘露醇、0.5％(w/v)bsa、300mm氯化钠、50mm氯化钾。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

制备试剂1：向50mmmops缓冲液(ph7.4)中加入终浓度为1.5％(w/v)的bsa、终浓度为2％(w/v)的peg8000、终浓度为5％(w/v)的多聚赖氨酸(mw5000)、终浓度为300mm的nacl、终浓度为0.05％(w/v)的tween-80、终浓度为0.1％(w/v)的proclin300、终浓度为5mm的edta，用0.22μm滤膜过滤后得试剂1；

制备试剂2：用50mmmes缓冲液(ph6.0)稀释相应粒径的羧基胶乳微球(273nm、-cooh量0.05-0.08mmol/g；70nm、-cooh量0.15-0.22mmol/g)至其质量浓度为1％，分别加入质量浓度为0.02％、0.06％的活化剂edc，在室温搅拌20min活化羧基；活化结束后，15000g离心、洗涤除去多余的edc；再加入标记缓冲液(50mmmops，ph7.4)，超声将胶乳微球分散，分别加入saa单克隆抗体(标273nm微球)、saa多克隆抗体(标70nm微球)单独标记，室温搅拌1h，再加入终止液继续搅拌10min；将最终的反应液以15000g离心，用50mmmops缓冲液(ph7.4)洗涤1次，用相应体积的保存液分别重悬标好胶乳(273nm微球终浓度为0.01％(w/v)、70nm微球终浓度为0.3％(w/v)，人saa单克隆抗体终浓度为0.005％(w/v)，人saa多克隆抗体终浓度为0.065％(w/v))，搅拌混匀，保存液的组分为：50mmhepes缓冲液(ph7.2)、100mm氯化胺、0.2％(w/v)明胶、0.5％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、0.5％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)tritonx-100、0.1％(w/v)的proclin300，得试剂2；

制备校准品：用上述成分的校准品基质液将体外表达的saa做稀释，进行溯源后赋值得到系列浓度的校准品(saa的系列浓度为0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l)。

实施例3

一种人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，包括试剂1、试剂2和不同浓度梯度的saa校准品；；其中，

试剂1包括下述终浓度的组分：50mmpbs缓冲液(ph7.4)，2％(w/v)的bsa，1％(w/v)的peg20000，2％(w/v)的mw为10000的pvp，100mm的nh4cl，0.1％(w/v)的tween-80，0.1％(w/v)的proclin300，10mm的edta；

试剂2包括下述终浓度的组分：只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为223nm，微球终浓度为0.015％(w/v))、0.0072％(w/v)的标记的人saa单克隆抗体、只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为83nm，微球终浓度为0.25％(w/v))、0.055％(w/v)的标记的人saa多克隆抗体、50mmtaps缓冲液(ph8.0)、50mm氯化镁、0.2％(w/v)明胶、0.2％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、1％(w/v)葡萄糖、0.05％(w/v)tween-20、0.1％(w/v)的krovin300；

校准品：含0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l六个浓度梯度的人saa，其基质液包括下述终浓度的组分：20mm的磷酸盐缓冲液(ph7.4)、3mm的edta二钾、2.5％(w/v)的枸橼酸钠、0.3％(w/v)的肝素锂、1.5％(w/v)海藻糖、0.2％(w/v)甘露醇、1％(w/v)bsa、200mm氯化钠、100mm氯化钾。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

制备试剂1：向50mmpbs缓冲液(ph7.4)中加入终浓度为2％(w/v)的bsa、终浓度为1％(w/v)的peg20000、终浓度为2％(w/v)的pvp(mw10000)、终浓度为100mm的nh4cl、终浓度为0.1％(w/v)的tween-80、终浓度为0.1％(w/v)的proclin300、终浓度为10mm的edta，用0.22μm滤膜过滤后得试剂1；

制备试剂2：用100mmmes缓冲液(ph6.0)稀释相应粒径的羧基胶乳微球(223nm、-cooh量0.06-0.10mmol/g；83nm、-cooh量0.25-0.38mmol/g)至其质量浓度为1％，分别加入质量浓度为0.03％、0.06％的活化剂edc，在室温搅拌20min活化羧基；活化结束后，15000g离心、洗涤除去多余的edc；再加入标记缓冲液(50mmhepes，ph7.4)，超声将胶乳微球分散，分别加入saa单克隆抗体(标223nm微球)、saa多克隆抗体(标83nm微球)单独标记，室温搅拌1h，再加入终止液继续搅拌10min；将最终的反应液以15000g离心，用50mmhepes缓冲液(ph7.4)洗涤1次，用相应体积的保存液分别重悬标好胶乳(223nm微球终浓度为0.015％(w/v)、83nm微球终浓度为0.25％(w/v)，标记的人saa单克隆抗体的终浓度为0.0072％(w/v)，标记的人saa多克隆抗体的终浓度为0.055％(w/v))，搅拌混匀，保存液的组分为：50mmtaps缓冲液(ph8.0)、50mm氯化镁、0.2％(w/v)明胶、0.2％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、1％(w/v)葡萄糖、0.05％(w/v)tween-20、0.1％(w/v)的krovin300，得试剂2；

制备校准品：用上述成分的校准品基质液将体外表达的saa做稀释，进行溯源后赋值得到系列浓度的校准品(saa的系列浓度为0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l)。

实施例4

一种人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，包括试剂1、试剂2和不同浓度梯度的saa校准品；其中，

试剂1包括下述终浓度的组分：50mmtris-cl缓冲液(ph8.0)，2％(w/v)的bsa，3％(w/v)的peg8000，0.2％(w/v)的mw为500000的葡聚糖，50mm的mgcl2，0.05％(w/v)的tritonx-100，0.1％(w/v)的proclin300，5mm的edta；

试剂2包括下述终浓度的组分：只标记有人saa单克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为240nm，微球终浓度为0.015％(w/v))、0.006％(w/v)的标记的人saa单克隆抗体、只标记有人saa多克隆抗体的羧基胶乳微球(平均粒径为70nm，微球终浓度为0.3％(w/v))、0.075％(w/v)的标记的人saa多克隆抗体、50mmmops缓冲液(ph7.2)、150mm氯化胺、0.2％(w/v)明胶、0.5％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、1％(w/v)葡萄糖、0.5％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)tween-80、0.1％(w/v)的krovin500；

校准品：含0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l六个浓度梯度的人saa，其基质液包括下述终浓度的组分：20mm的磷酸盐缓冲液(ph7.3)、5mm的edta二钠、3％(w/v)的枸橼酸钠、0.05％(w/v)的肝素锂、5％(w/v)海藻糖、0.2％(w/v)甘露醇、0.5％(w/v)bsa、150mm氯化钠、50mm氯化钾。

上述人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

制备试剂1：向50mmtris-cl缓冲液(ph8.0)中加入终浓度为2％(w/v)的bsa、终浓度为3％(w/v)的peg8000、终浓度为0.2％(w/v)的葡聚糖(mw500000)、终浓度为50mm的mgcl2、终浓度为0.05％(w/v)的trintonx-100、终浓度为0.1％(w/v)的proclin300、终浓度为5mm的edta，用0.22μm滤膜过滤后得试剂1；

制备试剂2：用50mmmes缓冲液(ph6.0)稀释相应粒径的羧基胶乳微球(240nm、-cooh量0.11-0.16mmol/g；70nm、-cooh量0.15-0.22mmol/g)至其质量浓度为1％，分别加入质量浓度为0.02％、0.06％的活化剂edc，在室温搅拌20min活化羧基；活化结束后，15000g离心、洗涤除去多余的edc；再加入标记缓冲液(50mmhepes，ph7.4)，超声将胶乳微球分散，分别加入saa单克隆抗体(标240nm微球)、saa多克隆抗体(标70nm微球)单独标记，室温搅拌1h，再加入终止液继续搅拌10min；将最终的反应液以15000g离心，用50mmpbs缓冲液(ph7.4)洗涤1次，用相应体积的保存液分别重悬标好胶乳(240nm微球终浓度为0.015％(w/v)、70nm微球终浓度为0.3％(w/v)，标记的人saa单克隆抗体终浓度为0.006％(w/v)，标记的人saa多克隆抗体终浓度为0.075％(w/v))，搅拌混匀，保存液的组分为：50mmmops缓冲液(ph7.2)、150mm氯化胺、0.2％(w/v)明胶、0.5％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、1％(w/v)葡萄糖、0.5％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)tween-80、0.1％(w/v)的krovin500，得试剂2；

制备校准品：用上述成分的校准品基质液将体外表达的saa做稀释，进行溯源后赋值得到系列浓度的校准品(saa的系列浓度为0.00、15.00、40.00、120.00、250.00、500.00mg/l)。

效果例1

对实施例1-4制备得到的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，用日立7180全自动生化仪进行测试，参数和步骤如下：测试主波长570nm，先加入加入样本2μl，再加入150μl试剂1，37℃孵育约5min后，加入50μl试剂2，约30s后读取吸光度a1，再反应约4min后读取吸光度a2(计算两者吸光度的差值⊿a＝a2-a1；

对实施例1-4的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒使用配套的6个校准品进行多点定标，得到定标曲线并进行线性分析，结果分别如图1a-图1d所示(图1a、1b、1c、1d)。其中，横坐标为定标液浓度，纵坐标为各浓度定标液对应的吸光度差值。样本的浓度(单位为mg/l)可通过其检测时的吸光度变化在定标曲线上计算得到。

对上述4个实施例的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒进行性能评测试验(使用方法同上述测试方法，日立7180型全自动生化仪)：

(1)空白检测限：试剂盒测定零值人saa纯品在波长570nm处的吸光度值3次，取其均值，结果见表1；

(2)功能灵敏度：试剂盒重复测试人saa含量为0.20mg/l的血清样本20次，分别计算测定浓度的平均值和标准差，再计算变异系数(cv)，结果见表1；用人saa含量为0.20mg/l的血浆样本或人saa纯品进行灵敏度测试，测得的变异系数cv值在可接受的范围内；

(3)准确度：按1:9的体积比将高值人saa纯品(300mg/l)加入到低值人saa纯品(20mg/l)中，用试剂盒进行测试对高值人saa纯品、低值人saa纯品和混合后样本各重复检测3次，取其浓度均值，计算回收率，结果见表1；

(4)精密度：试剂盒重复测试人saa含量为(80.00±10.00)mg/l的血清样本10次，分别计算测定浓度的平均值和标准差,再计算变异系数(cv)，结果见表1；用人saa含量为(80.00±10.00)mg/l的血浆样本或人saa纯品进行精密度测试，测得的变异系数cv值在可接受的范围内；

(5)线性：用校准品基质液将线性高值人saa纯品(600.00±60.00)mg/l在[0.20-500.00]mg/l范围内稀释出6个浓度样本(这6个浓度分别为0.20mg/l、4.00mg/l、20.00mg/l、100.00mg/l、250.00mg/l、500.00mg/l)，每个样本重复测定3次，取其均值。以稀释样本的理论浓度值为x轴，实测浓度值为y轴，建立直线方程，计算其线性相关系数r，结果见表1；

(6)抗干扰：试剂盒检测500mg/dl的血红蛋白、30mg/l的胆红素、3000mg/dl的甘油三酯和500iu/ml的抗类风湿因子(rf)样本各3次，取其测定浓度的均值，结果见表1。

从表1结果可知，本发明参数范围内制备的试剂盒均具备较好的空白检测限、灵敏度、准确度、精密度、线性和抗干扰能力。

表1

效果例2

检测临床样本的性能评价

实施例4的试剂(试剂盒的使用方法同上述测试方法)与对照试剂(西门子的血清淀粉样蛋白a散射比浊法测定试剂盒，使用方法参照其说明书)同时检测40例临床血清样本，评价二者的相关性，结果如图2所示(其中大于200mg/l的测值，对照试剂是先将样本稀释10倍后检测，再回算得出)。其中，横、纵坐标分别为对照试剂、实施例4的试剂的检测结果，单位均为mg/l。

实施例4的试剂与对照试剂同时检测40例临床肝素抗凝血浆样本，评价二者的相关性，结果如图3所示。其中，横、纵坐标分别为对照试剂、实施例4的试剂检测结果，单位均为mg/l。

实施例4的试剂同时检测40例临床血清及其对应的edta抗凝血浆样本，评价二者的相关性，结果如图4所示。其中，横、纵坐标分别为血清、edta抗凝血浆样本的检测结果，单位均为mg/l。

实施例4的试剂同时检测40例临床血清及其对应的枸橼酸钠抗凝血浆样本，评价二者的相关性，结果如图5所示。其中，横、纵坐标分别为血清、枸橼酸钠抗凝血浆样本的检测结果，单位均为mg/l。

临床样本相关性的结果表明，本发明提供的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒能很好地满足临床血清样本和肝素抗凝血浆样本的检测；并通过与血清样本的比对，研制试剂还能很好地检测edta抗凝和枸橼酸钠抗凝的血浆样本；且本发明提供的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒有更高的灵敏度和更宽的检测范围，能更好地满足临床需求。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。