一种降低微球非特异性吸附的方法及应用与流程

本发明属于检测技术领域，尤其是涉及一种降低微球非特异性吸附的方法及应用。

背景技术：

近年来，核酸检测广泛应用在疾病诊断、遗传学、犯罪学、食品安全等领域，以微球为载体（例如：磁性微球、荧光微球等）的dna检测更是成为研究热点。

微球对dna片段和蛋白的非特异性吸附会造成检测灵敏度降低，更甚至会造成检测结果错误。在实际检测中，特别是多指标检测，非特异性吸附又无法避免，样本中含有多种dna片段或多种蛋白，很容易造成非特异性吸附。

造成非特异性吸附的主要原因是疏水作用和静电作用；目前主要从两个方面改变非特异性吸附，一方面是利用封闭剂对微球表面非特异性位点进行封闭，阻碍了非特异性吸附；另一方面是对微球表面进行改性，这种方法从本质上改变非特异性吸附。

降低非特异性吸附的表面修饰主要有以下几种方式：利用有机物对磁性微球进行表面修饰，例如peg修饰的微球，有效的抵制了非特异性吸附；利用天然的高分子对微球进行表面修饰，例如yang-chuangchang等利用壳聚糖制备了微球；利用无机分子进行表面修饰，利用sio2对微球进行包裹，可以保护微球不被外界环境所腐蚀，在sio2表面进行功能化，不仅提高微球的应用范围而且有效降低非特异性吸附；利用生物分子对微球进行表面修饰，利用特殊性质的生物分子降低非特异性吸附。

以上这些方法操作复杂，且应用范围窄，因此，急需提供一种降低微球非特异性吸附的方法及应用。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种降低微球非特异性吸附的方法。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种降低微球非特异性吸附的方法，所述降低微球非特异性吸附的方法包括：在氨基微球的表面先修饰一层含羧基或者酯基的高分子聚合物，然后再修饰含羧基或者酸酐的有机小分子并将微球表面的氨基全部转化成羧基以降低微球对dna片段和/或蛋白的非特异性吸附。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述含羧基的高分子聚合物包括：聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和聚马来酸中的至少一种；所述含酯基的高分子聚合物包括：聚甲基丙烯酸甲酯。

优选地，所述有机小分子包括：乙酸酐、丁二酸酐、马来酸酐、乙酸和丙酸中的至少一种。

本发明的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种微球。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种微球，所述微球由前文所述的降低微球非特异性吸附的方法制备得到。

本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种微球在对dna片段和/或蛋白的非特异性吸附方面的应用。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种如前文所述的微球在对dna片段和/或蛋白的非特异性吸附方面的应用。

本发明提供一种降低微球非特异性吸附的方法、所制备得到的微球及应用，首先，对制备得到的氨基微球的表面进行含羧基或者酯基的高分子聚合物的修饰，然后再对修饰后的微球进行含羧基或者酸酐的有机小分子的修饰，经两次修饰后的羧基微球在生物应用过程中，有效地降低了微球对dna片段和/或蛋白的非特异性吸附。本发明所提供的方法操作简单，容易控制，所制备得到的羧基微球可以广泛地引用于生物标记、生物分离以及体外诊断等领域。

附图说明

图1为本发明的实施例1中的微球在修饰前、paa修饰后以及saa修饰后的电位图。

图2为本发明的实施例2中的微球在经paa和saa修饰后和修饰前的非特异性吸附的结果图。

图3为本发明的实施例3中paa与修饰前的微球质量比分别为1:10、1:6.67、1:3.33以及1:2，saa与修饰前的微球的质量比为1:1.4的比例下修饰后的微球的非特异性吸附的结果图。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例1

（1）称取3mg聚丙烯酸溶液（paa）溶解于1mlmest缓冲溶液（10mm，ph5.0）中，加入10mg微球（由羧基子球和氨基母球形成的主客体结构），混合均匀后，在垂直混合仪上反应30min。反应结束后，称取10mgedc溶于1mlmest缓冲溶液。将edc/mest溶液加入到上述混合溶液中，混合均匀后，在垂直混合仪上反应2h。反应结束后，水洗三次，分散在1ml超纯水中。

（2）称取3.57mg丁二酸酐（saa）溶解于2ml无水乙醇中，将步骤（1）制备的微球磁分离去上清，加入2mlsaa/乙醇溶液，垂直混合仪上反应24h。反应结束后，用乙醇洗三次，再水洗三次，分散在1ml的超纯水中。如图1所示，图1为本发明的实施例1中的微球在修饰前、后的电位图；修饰前，微球的电位为-29.5mv，经paa修饰后，微球的电位为-31.2mv，经saa修饰后微球的电位为-40.3mv，也就说明在微球表面引入了羧基基团。

实施例2

（1）分别取10mg微球于3个离心管中，磁分离去上清，称取9mgpaa溶解于3ml10mmmest中，每管加入1mlpaa/mest溶液，混合均匀后，在垂直混合仪上反应30min。反应结束后，称取30mgedc溶于3ml10mmmest中。将每管再加入1mledc/mest溶液，混合均匀后，在垂直混合仪上反应2h。反应结束后，水洗三次，分散在1ml的超纯水中。

（2）称取3.57mgsaa溶解于2ml无水乙醇中。将步骤（1）制备的微球磁分离去上清，每管加入2mlsaa/乙醇溶液，垂直混合仪上反应24h。反应结束后，用乙醇洗三次，再水洗三次，分散在1ml的超纯水中。

（3）取步骤（2）修饰后的微球2µg和未进行步骤（1）和（2）修饰的微球2µg，分别用杂交液（0.2mtrisph7.4）洗涤1次。再分别加入10µl非特异性扩增产物，88µl杂交液，在50℃，杂交30分钟。用杂交液洗涤一次，分散在50µl超纯水中，进行流式检测，流式结果如图2所示，表明：经历paa和saa修饰后的微球，非特异性吸附值显著降低。扩增产物上连有荧光物质，可以通过流式apc通道进行检测，检测到的荧光强度越高，说明非特异性吸附越强。

实施例3

（1）称取2mg，3mg，6mg，10mg聚丙烯酸溶液（paa）分别溶解于1mlmest中，再分别加入10mg微球，混合均匀后，在垂直混合仪上反应30min。反应结束后，称取40mgedc溶于4mlmest缓冲溶液中。分别加入1mledc/mest溶液到上述混合溶液中，混合均匀后，在垂直混合仪上反应2h。反应结束后，水洗三次，分散在1ml的超纯水中。

（2）称取14.28mgsaa溶解于8ml无水乙醇中。将步骤（1）制备的微球磁分离去上清，每管加入2mlsaa/乙醇溶液，垂直混合仪上反应24h。反应结束后，用乙醇洗三次，再水洗三次，分散在1ml的超纯水中。

（2）分别取2µg由步骤（2）制备得到的微球，用杂交液（0.2mtrisph7.4）洗涤1次。加入10µl非特异性扩增产物，加入88µl杂交液，在50℃，杂交30分钟。用杂交液洗涤一次，分散在50µl超纯水中，进行流式检测，流式结果如图3所示，表明：微球与paa的质量比为10:1.5时，非特异性吸附值最低。扩增产物上连有荧光物质，可以通过流式apc通道进行检测，检测到的荧光强度越高，说明非特异性吸附越强。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在发明的精神和权利要求的保护范围内，对发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。