一种SERS芯片的制作方法

本实用新型涉及表面增强拉曼(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)技术，特别是一种SERS芯片。

背景技术：

拉曼光谱是一种散射光谱，拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。该技术因其快速、简单、可重复、无损伤的定性定量分析优势，而被广泛应用于化学、物理学、生物学和医学等各个领域，在纯定性分析、高度定量分析和测定分子结构方面也展现独特优势。SERS增强源包括贵金属溶胶和增强基底。

现有的SERS研究中，研究者都集中在制备可控的、可重复的、热点集中的金属纳米结构SERS基底。如专利号：201610658664.6，专利名称为：一种制备有序银纳米球阵列方法的发明专利，采用在有序的铝纳米碗OAB阵列模板样品的表面蒸镀一层10nm厚的银膜，之后OAB模板在500℃下真空退火1h，得到有序的银纳米阵列结构，该方法银纳米球高度有序，尺寸分布大小可调，但蒸镀及退火工艺繁琐，成本较高。专利号：201610327475.0，专利名称：一种大面积表面增强拉曼散射基底及其制备方法，先制备了三维微米结构的模板，蒸镀一层银，形成银纳米颗粒，之后蒸镀一层氧化物，再蒸镀一层银，得到大面积SERS基底，方法虽具有较高的SERS活性，但操作繁琐，不利于商业化生产。专利号：201610929950.1，专利名称：一种贵金属纳米粒子间距可控的SERS衬底制备方法，采用盐酸清洗AAO模板，后采用物理或化学方法获得贵金属纳米粒子团簇，并填满整个AAO模板孔。进一步将AAO模板导致在PMMA上，热处理，使得贵金属团簇浸入到PMMA中，通过盐酸清洗，除去AAO模板，干燥后得到贵金属纳米粒子规则分布的SERS衬底。该方法转移模板及盐酸清洗操作繁琐，将AAO转移到其他模板上很难实现大面积制备，且成本高。现有技术中很少有功能化的SERS基底。

另外，目前，通常采用免疫分析法来检测生物分子，而免疫分析方法通过需要二抗或三抗，因此存在材料耗损严重，且需要有色底物或外部标记为进行显示，进一步增加耗材，从而使得成本较高。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种功能化的SERS芯片，该功能化的SERS芯片能够按照人为设计去检测特定的目标分子或生物分子，进而构造分子器件或超分子器件，拓展SERS在特殊分子及生物医药方面的应用。

为解决上述技术问题，本实用新型采用如下技术方案：

本实用新型提供一种SERS芯片，包括SERS衬底和设置在所述SERS衬底表面的多个纳米结构单元，所述纳米结构单元包括设置在所述SERS衬底表面的多个凹坑、设置在所述凹坑内的纳米粒子聚集体层，所述的纳米结构单元还包括连接在所述纳米粒子聚集体层表面的功能分子层，所述功能分子层用于将待测分子固定到所述纳米粒子聚集体层表面。

优选地，所述功能分子层由一种或多种功能分子组成，所述功能分子包括至少第一官能团和第二官能团，所述第一功能团用于连接所述纳米粒子聚集体层，所述第二功能团用于连接待测分子。

进一步优选地，所述第一功能团包括-SH、＝S、-NH2、＝NH、≡N中的至少一种；所述第二功能团包括SH、＝S、-NH2、＝NH、≡N、-NO2、-COOH、-OH、烷基中的至少一种。

将-SH或＝S记为A，-NH2记为B1，＝NH记为B2，≡N记为B3，-NO2记为C，-COOH记为D，-OH记为E，烷基记为F，功能分子中的其他部分记为X。

所述功能分子可以是A-X-A组合：如1,2-乙二硫醇、1,6-己二硫醇、对巯基对苯二甲酸、双(巯基乙酸)乙二醇，双巯基-聚乙二醇，对巯基苯硫酚，2,4,6-三巯基-1,3,5-三嗪，2-巯基苯并噻唑等；A-X-B1组合：如等巯基乙胺，巯基丙胺、巯基丁胺、对巯基苯胺，间巯基苯胺，临巯基苯胺，5-氨基-2-巯基苯并咪唑、2-氨基-苯并噻唑等；A-X-B2组合：如6-巯基嘌呤，8-巯基腺嘌呤、2-巯基苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑-4-甲酸、2-巯基苯并咪唑-4-甲酸甲酯、5-(1H-吡咯-1-基)-2-巯基苯并咪唑、5-乙氧基-2-巯基苯并咪唑、5-溴-2-巯基苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑-5-磺酸钠二水合物、3-氰基苯乙酮、5,6-二氯苯并咪唑-2-硫醇、5-氯苯并咪唑-2-硫醇、2-巯基-5-甲氧基苯并咪唑、4-氨基-6-巯基吡唑[3,4-d]嘧啶、1,2-亚乙基硫脲、甲巯咪唑、2-巯基咪唑等；A-X-B3组合：如亚甲基蓝、2-巯基-5-甲基苯并咪唑、巯基咪唑丙磺酸钠等；A-X-C组合：对硝基苯硫酚、2-巯基-5-硝基苯并咪唑等；A-X-D组合：巯基乙酸、巯基丙酸、A-巯基异丁酸、4-巯基苯甲酸、巯基异丁酸、2-巯基丁二酸、5-巯基-1,2,3,4-四氮唑-乙酸、2-巯基苯并噻唑乙酸、二巯基丁二酸等；A-X-E组合：巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇、巯基戊醇、4-羟基苯硫酚等；A-X-F组合：巯基乙烷，巯基丁烷，巯基戊烷、巯基己烷、3-己硫醇、苯硫酚等；A-X组合：4-巯基苯硼酸、对疏基苯磺酸、4-甲苯硫酚、巯基丙酸甲酯等。

B1-X-B1组合：如1,6己二胺，对氨基苯胺，间氨基苯胺，邻氨基苯胺、三聚氰胺、2-(4-氨基苯)乙胺、4,5,6-三氨基嘧啶硫酸盐、吖啶橙盐酸盐、吖啶黄素、盐酸吖啶黄、3,5-二氨基吖啶盐酸盐、溴甲菲啶、碱性品红、结晶紫、3,6-二氨基吖啶、俾斯麦棕Y、6-苄氨基嘌呤、N-苄基-氨基嘌呤、溴化乙锭、4-氨基-5-咪唑甲酰胺盐酸盐、罗丹明110、硫堇醋酸盐等；B1-X-B2组合：如醋酸甲酚紫、腺嘌呤、8-氮杂-腺嘌呤、4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶、6-氨基嘌呤、2-碘-6-氨基嘌呤、2-氟-6-氨基嘌呤、2-溴-6-氨基嘌呤、腺嘌呤盐酸盐、碱性蓝等；B1-X-B3组合：如盐酸氯丙嗪、磺胺嘧啶银(I)、9-氨基-吖啶、盐酸氨吖啶、9-胺-1,2,3,4-四氢盐酸氯酯等；B1-X-C组合：如对硝基苯胺，间硝基苯胺、邻硝基苯胺、2-乙氧基-6-硝基-9-氨基吖啶等；B1-X-D组合：l-谷氨酰胺、氨基酸等；B1-X-E组合：酪氨酸、(2R)-3-(6-氨基嘌呤-9-基)丙烷-1,2-二醇、2-氨基-羟基苯-4-磺酰胺、氨基(羟基亚氨基)乙酸甲酯、邻苯二甲酰亚氨基羟基丁酸、氨基(羟基亚氨基)乙酸甲酯等；B1-X-F组合：甲胺、乙胺、丙胺等；B1-X组合：苯胺、9-氨基芴盐酸盐、2-氨基-1,1,3-三氰基丙烯、甲酰胺等。

B2-X-B2组合：如N6-苯甲酰基腺嘌呤、1,3-二亚氨基异吲哚啉等；B2-X-B3组合：如6-氰基嘌呤等；B2-X-C组合：3-硝基邻苯亚胺等；B2-X-D组合：亚氨基酸等；B2-X-E组合：如玉米素等；B2-X-F组合：乙基亚胺、丙级亚胺等；B2-X组合：邻苯二甲酰亚胺、4-溴邻苯二甲酰亚胺等。

B3-X-B3组合：罗丹明B、罗丹明6G、叔胺等；B3-X-C组合；B3-X-D组合：4-马来酰亚胺基苯甲酸等；B3-X-E组合；B3-X-F组合：乙基亚胺等；B3-X组合十二烷基叔胺等。

当然功能分子还可以是上述物质的衍生物。

最优选地，功能分子为具有A-X-A,A-X-B1,A-X-B2,B1-X-B1和B1-X-B2的分子中的一种或多种。

优选地，所述功能分子通过共价键结合在所述纳米粒子聚集体层表面上形成功能分子层，共价键作用牢固，不易脱落。检测时，待测分子可以直接连接在功能分子层上实现待测分子的固定。

优选地，所述的纳米粒子聚集体层由纳米粒子通过自组装在所述凹坑内形成。

进一步优选地，对所述的衬底和/或所述的纳米粒子进行疏水修饰后进行自组装。

优选地，所述纳米粒子的粒径为2nm～800nm，优选为30nm～120nm。

优选地，所述金属纳米粒子的材质包括金、银、铜、铂、铝中的一种或多种，或者，所述金属纳米粒子为合金结构或者核壳结构。

进一步地，合金结构可以为金、银、铜、铂、铝中任意两种或三种的合金结构。例如，合金结构包括AuAg,AgCu,AuC，AuPt，AgPt等具有SERS活性的合金结构。

核壳结构包括具有双组份的核壳结构，例如Au@Ag，Ag@Au，Au@Pt，Fe3O4@Au，Fe3O4@Ag，Au@SiO2，Ag@SiO2等，其中@前面的物质为核，后面的物质为壳。

优选地，所述的金属纳米粒子具有规则或不规则形状。例如，所述的金属纳米粒子的形状包括球形、块状、片状或棒状等且不限于此。

本实用新型中，金属纳米粒子可以以分散液的形式进行使用，而分散液进一步可以是金属纳米粒子溶胶。金属纳米粒子可以通过湿法工艺合成，其形貌、尺寸亦可以是被方便的调控的，相应的工艺过程及条件可以参考但不限于如下文献1：Angew.Chem.Int.Ed.45,3414。

优选地，所述的分散液中金属纳米粒子的浓度为1×10⁹个/mL～1×10¹¹个/mL。

本实用新型中，可以通过添加溶剂的方法来调节金属纳米粒子的浓度，而采用的溶剂可以是本领域的常规溶剂。

优选地，所述的衬底包括无机基材、有机基材或者无机/有机复合基材，例如玻璃，单晶硅，塑料，聚四氟乙烯材料，聚苯乙烯材料，金属及金属氧化物等。

本实用新型中，所述凹坑在所述衬底的整个表面上间隔分布，即凹坑与凹坑之间形成有间隙，而非连接成一体。

优选地，所述凹坑的密度为10⁸～10¹⁰个/cm²衬底。

优选地，相邻二个所述凹坑之间的最小间隔距离为1～50nm，进一步优选为5～50nm，更优选为10～30nm。

本实用新型中，相邻二个凹坑之间的最小间隔距离指的是一个凹坑的上边缘上的任意点与相邻的一个凹坑的上边缘上的任意点之间的多个距离中最小的距离。

优选地，所述凹坑的深度范围为30nm～2μm，优选为30nm～300nm，进一步优选为40nm～300nm，更优选为40nm～200nm。

本实用新型中，凹坑的深度指的是凹坑的上边缘所在面至凹坑底面的最大距离。

优选地，口部直径范围为50nm～4μm，优选为30nm～4μm，进一步优选为30nm～500nm，更优选为40nm～200nm。

本实用新型中，凹坑的口部直径指的是凹坑上边缘上的任意两点之间的多个距离中的最大的距离，当凹坑的上边缘围成的面呈圆形时，凹坑的直径为该圆形的直径；当凹坑的上边缘围成的面呈方形时，凹坑的直径为该方形的对角线；当凹坑的上边缘围成的面为三角形时，凹坑的直径为该三角形的最长边；当凹坑的上边缘围成的面呈椭圆形时，凹坑的直径为该椭圆的长轴。

本实用新型通过控制凹坑之间的最小距离和/或凹坑的密度和/或凹坑的口部直径，可以实现纳米结构单元的高密度堆积，利于进一步加强SERS效应。进一步的，本实用新型可以做到凹坑和金属纳米粒子的直径尽可能小，从而使得芯片的活性更好，稳定性、均匀性和可重复性更佳。

优选地，所述的凹坑通过等离子刻蚀、紫外刻蚀、化学刻蚀、激光刻蚀、机械钻孔、机械冲压、纳米球印刷术或电化学法制得。

例如，前述的表面具有多个凹坑的衬底可以通过纳米球印刷术或电化学法等工艺制备，具体可参考但不限于如下文献2：J.Am.Chem.Soc.127，3710；Chem.Commun.53,7949。

优选地，所述的纳米结构单元还包括连接在所述的功能分子层上的抗体层。

进一步优选地，所述的抗体层由一种或多种抗体组成。

本实用新型的SERS芯片通过如下步骤制得：

(1)提供SERS基底，所述SERS基底包括衬底、设置在所述的衬底表面的多个凹坑、设置在所述的凹坑内的纳米粒子聚集体层；

(2)在所述的纳米粒子聚集体层表面连接功能分子形成功能分子层，所述功能分子层用于将待测分子固定到所述纳米粒子聚集体层表面。

优选地，所述的SERS芯片的制备方法还包括将抗体连接在功能分子层形成抗体层上的步骤。

本实用新型中的连接的抗体种类有多种，具体可以根据需要检测的抗原来选择合适的抗体进行连接。

本实用新型涉及到的是一种应用于表面增强拉曼光谱技术的增强基底的表面功能化。具体的说是对表面增强拉曼光谱技术的增强基底的进一步处理，即在特殊结构的基底表面修饰一层有序的分子膜，形成功能化的SERS基底，有序分子膜就像是一层分子手臂，可以抓取想要抓取的目标分子，通关过调节手臂的长短和手的大小，就可以抓取不同的目标分子，以便应用于不同的检测领域。本方法属于SERS检测的技术领域。

本实用新型的芯片可以用于多个不同检测领域，例如包括食品安全、国防安全、生物医药、环境安全等领域。

典型地用于本实用新型方法中的样品的非限制性实例包括：人和动物的体液，如全血、血清、血浆、脑脊液、痰液、支气管冲洗液、支气管吸出物、尿、精液、淋巴液，以及呼吸道、肠道和生殖泌尿道的各种外分泌物、泪、唾液、乳汁、白血球、骨髓瘤等；生物流体，如细胞培养物上清液；可固定或未固定的组织标本；以及可固定或未固定的细胞标本。本实用新型方法中使用的样品将基于分析形式以及待分析的组织、细胞、提取物或其它材料(特别是生物材料)的性质而变化。对来自细胞或样品的蛋白提取物进行制备的方法是本领域公知的，并可被容易地修改，从而得到与本实用新型的方法相容的样品。

由于以上技术方案的实施，本实用新型与现有技术相比具有如下优点：

本实用新型通过在基底上修饰一种或多种功能分子，使得芯片具备不同的功能，从而可以用于不同的检测领域。该芯片的制备工艺简单、效率高、成本低、能大规模地生产高性能SERS芯片，能很好的满足商业化的需求。本实用新型制得的SERS芯片，可重复性高，热点均匀，性质稳定，可大面积生长，灵敏度高。

附图说明

图1示意性地示出功能化SERS基底制作的原理，在基底上通过化学键的相互作用，将具有独特性质的分子连接在基底表面，使其具备特殊性能，而在检测待测物时，具备特异性，选择性结合目标待测物；

图2为实施例6测得的拉曼光谱图，其中，a为10^-6mol/L Pb²⁺；b为10^-7mol/L Pb²⁺；c为10^-8mol/L Pb²⁺；d为10^-9mol/L Pb²⁺；

图3为实施例6的拉曼强度对应的浓度的对数图；

图4为实施例7测得的拉曼光谱图，其中，a为10^-5mol/L Zn²⁺；b为10^-6mol/L Zn²⁺，c为10^-7mol/L Zn²⁺，d为10^-8mol/L Zn²⁺，e为10^-9mol/L Zn²⁺，f为空白；

图5为实施例7的拉曼强度对应的浓度的对数图。

具体实施方式

为了使本实用新型更加清楚，结合附图和实施例对本实用新型做进一步说明，应当理解，本实施例并不用于限定本实用新型的保护范围。本实用新型中未详细描述的方法和条件为本领域的常规条件。

实施方式一，如图1所示的SERS芯片，包括SERS衬底1和设置在SERS衬底1表面的多个纳米结构单元，纳米结构单元包括设置在SERS衬底表面的多个凹坑2、设置在凹坑2内的纳米粒子聚集体层3、连接在纳米粒子聚集体层3表面的功能分子层4，功能分子层用于将待测分子5固定到纳米粒子聚集体层3表面。

SERS衬底1包括无机基材、有机基材或者无机/有机复合基材。

凹坑2的深度范围为30nm～2μm，口部直径范围为50nm～4μm；凹坑2的密度为10⁸～10¹⁰个/cm²衬底，相邻二个凹坑2之间的最小间隔距离为1～50nm。

纳米粒子聚集体层3由纳米粒子通过自组装在凹坑2内形成。纳米粒子的粒径为2nm～800nm。纳米粒子的材质包括金、银、铜、铂、铝中的一种或多种，或者，纳米粒子为合金结构或者核壳结构。

功能分子层4通过功能分子共价键结合在纳米粒子聚集体层3表面上形成，功能分子层4由一种或多种功能分子组成，但各功能分子之间不发生化学反应生成新的物质。

功能分子包括至少第一官能团和第二官能团，第一功能团用于连接纳米粒子聚集体层3，第二功能团用于连接待测分子5。

第一功能团包括-SH、＝S、-NH2、＝NH、≡N中的至少一种；第二功能团包括SH、＝S、-NH2、＝NH、≡N、-NO2、-COOH、-OH、烷基中的至少一种。

实施方式二(无图示)，在实施方式一的基础上，纳米结构单元还包括连接在功能分子层上3的抗体层。

实施例1

一般功能化，基底表面无SERS活性的羧基化：将准备好的SERS基底至于用1mL硼砂缓冲液(pH＝9，1×10^-3mol/L)，加入10μL 1×10^-2mol/L巯基乙酸，室温下，浸泡2h，取出后大量水清洗，得到表面具有巯基乙酸功能化的SERS基底。此基底可以用来检测很难与基底有相互作用且会与羧基发生反应的分子。

实施例2

一般功能化，基底表面具有SERS活性的羧基化：将准备好的SERS基底至于用1mL硼砂缓冲液(pH＝9，1×10^-3mol/L)，加入10μL 1×10^-2mol/L巯基苯甲酸，室温下，浸泡2h，取出后大量水清洗，得到表面具有巯基苯甲酸功能化的SERS基底。此基底可以用来检测很难与基底有相互作用且会与羧基发生反应的分子，待测分子与巯基苯甲酸相互作用，改变了巯基苯甲酸的SERS信号，利用原SERS信号与新SERS信号的差别，来判断待测物质的结构与浓度。

实施例3

特殊功能化用于生物抗原检测：将准备好的SERS基底至于用1mL硼砂缓冲液(pH＝9，1×10^-3mol/L)，加入10μL 1×10^-2mol/L巯基苯胺，室温下，浸泡2h，取出后大量水清洗，得到表面具有巯基苯胺功能化的SERS基底。放置于1mL硼砂缓冲液(pH＝9，1×10^-3mol/L)中，加入10μL 1mg/mL羊抗兔IgG，室温下振荡孵化2h，去除上层清液，用1mL硼砂缓冲液冲洗，将10μL BSA(牛血清蛋白)(1％)加入其中，封闭活性位，室温下振荡孵化2h，之后硼砂洗涤缓冲液两次后，保存于硼砂缓冲液重悬浮中4℃备用。此功能化基底可以用来检测不同浓度的羊抗原，根据前后SERS信号的变化，来判断待测物质的结构与浓度。

实施例4

特殊功能化用于生物抗原检测：将准备好的SERS基底至于用1mL硼砂缓冲液(pH＝9，1×10^-3mol/L)，加入10μL 1×10^-2mol/L 2-氨基-6-羟基-8-巯基嘌呤，室温下，浸泡2h，取出后大量水清洗，得到表面功能化的SERS基底。放置于1mL硼砂缓冲液(pH＝9，1×10-3mol/L)中，加入10μL 1mg/mL羊抗兔IgG，室温下振荡孵化2h，去除上层清液，用1mL硼砂缓冲液冲洗，将10μL BSA(牛血清蛋白)(1％)加入其中，封闭活性位，室温下振荡孵化2h，之后硼砂洗涤缓冲液两次后，保存于硼砂缓冲液重悬浮中4℃备用。此功能化基底可以用来检测不同浓度的羊抗原，根据前后SERS信号的变化，来判断待测物质的结构与浓度。

实施例5

制备羧基重金属粒子标记物：取1ml，0.002mg/ml的金溶胶加入10μL 1×10^-3mol/L巯基苯甲酸，室温下，震荡20min，离心洗涤3次，分散在1ml水中。

实施例6

重金属粒子检测：取实施例1基底若干份，分别加入0.5ml实施例5标记物后，分别加入0.5ml不同浓度的Pb²⁺溶液浸泡20min后，使用大量水清洗后吹干，用拉曼测试。

实施例7

重金属粒子检测：取实施例1基底若干份，分别加入0.5ml施例5标记物后，分别加入0.5ml不同浓度的Zn²⁺溶液浸泡20min后，使用大量水清洗后吹干，用拉曼测试。