集成黑白目标的显微镜载片的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年6月15日提交的美国临时no.62/520178的优先权，其每一个的公开内容通过引用整体结合于此。

本发明涉及具有集成目标的显微镜载片。本发明尤其涉及具有集成黑白目标的显微镜载片。如本发明所公开的具有集成黑白目标的显微镜载片，使得在不同系统上的数字成像能够设置照明水平，使得过程控制目标阵列和共存组织可以一起使用并产生相似的结果。

背景技术：

在以往的方式，成像系统针对标准的白和黑目标，通过调整照明源强度和对比度进行了校准。两者均应在表面光洁度上不反射。公认的基准白参照是新鲜压制的硫酸钡片剂，其压制用于macbethpcmii。黑色通常由空洞提供，该空洞防止反射光返回到成像设备。

白目标将是某种金属氧化物，除非其表面受到保护，否则其会因接触曙红而染色。虽然可以印刷出包含碳化合物的黑目标，但它会产生一定程度的第一表面反射，因此不是理想的黑色。但是，相对于生物材料可能发生的任何染色，它会足够黑。

许多成像系统包含白色以及黑色空洞参照目标，该参照目标用于在引入要成像的对象之前设置照明级别。在提供最宽范围的同时，载片上的动态范围小于理想值的50％。

由于时间的流逝和不同的染色经验，在载片之间产生相同结果的不一致是在显微镜载片上处理成像基线的主要缺点。

因此，本发明的目的是将黑白参照目标集成在载片本身上。因此，成像参照是载片的一部分，可以确保不同成像系统之间的接近结果。

技术实现要素：

总体地，本发明的一个方面公开了一种具有集成黑白目标的显微镜载片，其确保不同系统上的数字成像将能够设置照明水平，从而可以共同使用过程控制目标阵列和共存的组织切片，并产生相似的结果。

在另一方面，本发明公开了白目标不会是完美的，它将代表载片上最白的物体。

在又一方面，本发明公开了黑目标设置摄像机的动态范围。

在还一方面，本发明公开了在显微镜载载片中包括共存目标以提供客观值，通过该客观值可以评估染色特异性目标和组织切片本身。

在以下描述中公开了本发明的其他方面。

附图说明

图1说明了用于h&e的载片，其中包含与对苏木素和曙红y染色具有反应性的化学目标相同的行上的黑白成像目标。黑目标在右边，并且白目标在右边。对于同一张载片，显示了三个图像：左边是施加组织切片之前的载片，中间有已经施加的三个组织切片，右边是染色后的载片。灰色区域表示目标上或捕获的甲醛固定组织切片上的石蜡屏蔽。

具体实施方式

通过参考以下本发明的详细描述，可以更容易地理解本发明，该详细描述形成本公开的一部分。应当理解，本发明不限于在此描述和/或示出的特定设备、方法、条件或参数，并且在此使用的术语仅是示例性的，并不意图限制所要求保护的发明。另外，如在包括所附权利要求书的说明书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数，并且除非明确指出，否则对特定数值的引用至少包括该特定值。当在另一个实施例中表示范围时，该范围在此可以表示为“大约”或“近似”另一个特定值。此外，应当理解，除非另外指出，否则本文所述的尺寸和材料特性是作为示例而非限制，并且是为了更好地理解合适用途的样本实施方式，并且取决于特定的应用，所述值以外的变化也可以在本发明的范围内。

本发明不限于在其应用中所阐述的结构细节和组件的布置。在下面的描述中。本发明能够有其他实施例并且能够以各种方式被实施或执行。同样地，本文中出于描述的目的而使用的措词和术语不应视为限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变体以及其他项目的使用。

现在将详细参考本发明的优选实施方式。

从历史上看，参照对照载片的结果完全是主观的，因为不包括黑白参照目标，目标的密度不一致，并且对单一染色试剂的反应性独特。参照对照载片最多具有一个香肠状物，该香肠状物包含含有已知抗原位点的部分。抗原浓度是未知的，因此所有可能来自染色载片的是，试剂似乎都以足以指示抗原存在的水平起作用。对于经过ihc处理的载片，则无法进行客观测量，因为结果是抗原恢复、一级染色试剂和二级染色试剂的累积产物。因此，参照对比载片充其量只能为用户提供一些舒适感，使它们看起来能够运作。

包含染色的生物材料的显微镜载片的数字成像技术正在发展，以对染色的材料进行预筛选和潜在的全面诊断确定。一般而言，成像系统必须调整照明光水平，以使数字图像在白色或黑色边界处都不会处于压缩状态。常规解决方案是将黑白目标定位在预期将标签定位的位置。基本假设是白和黑目标代表载片可以呈现的极限。然而，这样做的话，数字尺度上存在压缩，因为相比组织切片的染色所能实现的黑色要黑得多，而白色则白得多。

在本发明的一个优选实施方式中，公开了一种显微镜载片，其包含与组织切片或疏松细胞沉积物共存的对照和参照目标。参照目标和组织切片记录了组织捕获和染色载片的盖片之间的处理经过。

在另一个实施方式中，在显微镜载片目标阵列之中的是共存的黑和白参照目标。黑白参照目标与其他目标和组织切片经过同样的试剂暴露和处理。

在另一个实施方式中，黑白参照目标使成像系统能够改变照明水平，从而扩大了工作范围。根据生物材料的类型，加工经过可能会发生可观地变化。

在另一个实施方式中，不同的处理途径可以分为但不限于免疫组织化学(ihc)，苏木素和曙红(h&e)加上特异染色，尿液涂片h&e加上特异染色和巴氏染色(papanicolaoustain)(pap)涂片，其由五个组成三种溶液中的染料。

一般而言，纯黑色沉积目标很难生产，因为根据定义，它必须吸收所有光。经典的解决方案是仅仅提供一个空洞，以使光路以无法反射的方式折叠起来。最好的情况下，黑目标会有些反射，但通常足够好，因为载片上的其他物体几乎都不会如此黑。

在另一个实施方式中，两个目标，即黑和白目标都是印刷的涂料或墨沉积物，其与用于处理载片的任何试剂均不反应。理想情况下的白目标会是完美的白色。然而，几乎没有染色的生物材料有用性是从黑色变成白色的一半。因此，白色可以与完美的白色相差5-10％，仍然具有有用的价值。主要要求是，白色应为金属氧化物或硫酸盐成分，当不暴露在阳光下时，它随着时间的流逝而保持稳定。铝和钛氧化物更好满足要求。

在另一个实施方式中，公开了解决上述问题的优选方案。黑白目标均基于酸酐基环氧涂料基料，该涂料基料通过直接暴露在365nm的紫外线下而得到催化。酸酐催化剂由甲基四氢苯酐和六氟砷酸二苯基碘鎓组成。除了紫外线引发的酸酐外，酸酐还需要额外的热量才能起到催化环氧树脂交联的作用。列出了优选的紫外线引发酸酐及其伴随物，但是在搜索酸酐生产公司时，还可以找到其他解决方案。尽管可以根据需要构造此类涂料/墨，但通常是已购买的组件，已针对所使用的印刷方法进行了优化。涂料/墨的制造必须解决在颜料颗粒和环氧粘合剂之间实现良好润湿的困难。酸酐基涂料(当粘度低时也称为墨)通常将酸酐与环氧树脂混合在一起，因为适用期可能长达数月。降低粘度会是印刷行业相关人员的已知知识，并且配方会根据环氧混合物的施加表面和所用的印刷方法而有所不同。虽然通常使用热触发的酸酐环氧涂料/墨，但引发反应所需的热量可能会破坏可能与涂料/墨共存的生物材料(蛋白质、肽和化学目标)。

在另一个实施方式中，酸酐催化剂消除了基于氨基硅烷的催化剂发现的未反应的胺，否则其将支持非特异性染色。游离胺端基可以并且会将生物材料和某些特异染料两者捕获。具体地，这解决了载片处理试剂，特别是染色试剂对白目标的不希望有的染色的问题。作为涂料/墨表面上的游离胺端基，它既可以捕获第一抗体又可以捕获第二染色试剂，并被染色。因此，击败了在载片上具有集成白目标的价值。

在另一个实施方式中，黑色颜料使用直径小于2微米的碳尘，而白色使用氧化铝或氧化钛珠。氧化钛是用于该应用的优选金属氧化物。

在另一个实施方式中，众所周知，在配制环氧墨/涂料配方时，粘度和干燥时间由各种短链和长链醇和表面活性剂控制。表面活性剂的选择可使墨/涂料对这些载片所经过的染色剂和试剂具有反应性的范围。优选的配方完全避免使用表面活性剂。

在另一个实施方式中，目标的印刷可以通过垫印章或使用注射器的注射来完成，这是优选的方法，因为它支持对目标沉积更好的特征尺寸控制。

在另一个实施方式中，上述白目标由酸酐催化的环氧树脂内的金属氧化物颜料组成。在另一个实施方式中，上述黑目标由紫外线引发的酸酐催化的环氧树脂内的碳颜料组成。在另一个实施方式中，酸酐催化剂是通过直接紫外线光暴露而由紫外线引发的。使用紫外线引发的酸酐催化剂的主要优点是引发酸酐-环氧反应所需的热量超过了生物材料(蛋白质、肽和化学目标)可以耐受而不损坏。更重要的是消除可能与染色剂反应的任何游离胺。

本发明的优点：

a.集成的黑白目标与组织切片或显微镜载片上的疏松细胞共存。

b.集成的黑白目标与生物材料染色没有反应性。

c.集成的黑白目标暴露于抗原恢复活动而始终稳定：缓冲液、热量、持续期间和其他环境因素。

d.集成的黑白目标与羟基、胺、酰胺、酰肼和芳族苯化合物没有反应性。黑/白目标将暴露于可与所列端基反应的染色剂中。因此，为了确保目标不会被染色，端基必须是固有惰性的，例如-ch3或-c＝o。在大多数情况下，染色将通过特异的染色剂进行，这些试剂被设计为用于与所列端基特异地结合。例如，曙红y与金属氧化物结合。

实施例

实施例1

图1说明了一个h&e使用载片，其中包含一行目标，其两端由黑白颜料目标界定。颜料目标与特异染色剂目标分开印刷。使用修改的分配泵印刷黑/白目标。分配泵对通过中空管送入的环氧混合物进行吐出和抽吸循环，该中空管固定在载片表面上。当印刷头随吐出和抽吸循环而抬起时，沉积物仍保留为点。其余化学目标在另一个工位上印刷，并且载片通过紫外线曝光的通道，从而引发酸酐催化剂固化环氧树脂。

购买环氧加酸酐预混合。为了确保均匀性，将环氧混合物搅拌，然后脱气。购买涂料/墨时已掺入了颜料。许多供应商都可以提供这种涂料/墨，但是在所有情况下，配方都是该供应商专有的，并且可能各个供应商不同。使用供应商推荐的稀释剂可以根据需要调节粘度。白色颜料是硫酸钡，可避免与特异染色发生大多数化学相互作用。这与可能与曙红y反应的二氧化钛或氧化铝相反。