利用尺寸排阻色谱法的细胞外囊泡的分析方法及其用途与流程

本发明涉及利用尺寸排阻色谱法分析细胞外囊泡的方法及其用途，更具体地，涉及通过利用尺寸排阻色谱法基于尺寸的分级能力以及与细胞外囊泡特异性结合的探针而分析样品中包含的细胞外囊泡的方法。

背景技术：

细胞外囊泡是通过细胞的普遍机制在体内或体外从几种类型的细胞中释放的纳米级生物颗粒，是具有在20nm至1,000nm范围内的各种尺寸的膜囊泡，存在于诸如血液、尿液、唾液和泪液的体液中，并且含有衍生自细胞的脂质双分子层。

这些细胞外囊泡参与各种生命现象中的若干重要功能。衍生自真核细胞的细胞外囊泡参与红细胞分化、免疫应答调节等，并且特别地，已经发现，这些细胞外囊泡在癌症进展、转移或癌细胞微环境中的血管生成中起重要作用，因此在用作包括癌症在内的各种疾病的诊断标志物方面受到了广泛的关注。

与衍生自真核细胞的细胞外囊泡相似，从原核细胞释放的细胞外囊泡含有原核细胞的成分，根据其进入人体的途径，不仅会引起全身性炎症，而且会引起急性肺炎症疾病。据报道，这些细胞外囊泡在局部皮肤组织中引起慢性炎症应答，从而引起特应性皮炎，这是现代人的代表性疾病之一。由于据报道衍生自细菌的细胞外囊泡与包括人体癌症在内的各种疾病相关，因此，衍生自原核细胞的细胞外囊泡也受到了广泛的关注。

细胞外囊泡由衍生自母细胞的物质(例如，蛋白质、脂质、核酸和氨基酸)组成，并充当在活体内携带这些物质的载体，因此对构成细胞外囊泡的蛋白质、脂质、核酸和氨基酸的分析为了解母细胞的生理和病理特征提供了重要基础。因此，在基础和医学领域中，各种样品中存在的细胞外囊泡成分的分析受到了广泛的关注。

此外，已知细胞外囊泡中所含的核酸、生长激素、蛋白质等受细胞膜型磷脂保护，因此与可溶形式的生长因子和细胞因子相比，可以发挥更稳定的功能，因此，细胞外囊泡日益重要，并且对细胞外囊泡中所含物质的分析有望用于多种用途，包括疾病的诊断和治疗。

近年来，已经从各种角度研发了非侵入性液体活检在疾病诊断中的应用。此外，已经做出努力通过利用体液中的细胞外囊泡来发现新的疾病诊断标志物，以及研发使用该标志物的诊断方法。诊断方法研发的关键是通过使用探针快速准确地定量少量样品中的目标物质。因此，通过使用探针对生物样品中存在的细胞外囊泡的成分进行分析是非常重要的。然而，这种细胞外囊泡成分的分析是在通过超速离心的纯化的基础上进行的，其步骤复杂且效率低。这种超速离心在分离细胞外囊泡方面产率低，导致不能有效去除不与细胞外囊泡结合的探针，因此，在具有相对有限量且表现高复杂性的体液中使用所述方法进行定量分析几乎是不可能的。因此，迫切需要研发不同于常规的细胞外囊泡分析并且可以快速进行且程序简单的新技术。

具体实施方式

技术问题

本发明的一个方面提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，该方法包括：

(a)将探针与含有细胞外囊泡的样品混合，之后进行反应，其中，每个探针均包含与细胞外囊泡的成分特异性结合的结合部分，以及可检测的信号部分；

(b)将混合的样品注射通过尺寸排阻色谱柱，之后进行显影；以及

(c)从该显影样品中检测细胞外囊泡-探针复合物以及游离探针。

本发明的另一个方面提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，该方法包括：

(a)将探针与含有细胞外囊泡的样品混合，之后进行反应，其中，每个探针均包含与细胞外囊泡的成分特异性结合的结合部分，以及可检测的信号部分；

(b)将混合的样品注射通过尺寸排阻色谱柱，之后进行显影；

(c)从该尺寸排阻色谱柱中分离细胞外囊泡-探针复合物；以及

(d)从该分离的细胞外囊泡-探针复合物中检测探针。

技术方案

鉴于上述问题而提出本发明，并且本发明的一个方面在于提供通过将样品和与细胞外囊泡的成分特异性结合且作为形成细胞外囊泡-探针复合物的探针的各种物质一起进行温育，之后利用尺寸排阻色谱法进行显影，然后检测探针而分析细胞外囊泡的方法。

如本文所使用的，术语“尺寸排阻色谱法(sec)”是指基于各种尺寸的溶质通过多孔基质的速率(渗透性)而分离混合物的技术。也就是说，该技术基于以下原理：当作为分析目标的样品通过填充有多孔固定相(例如凝胶、基质或珠)的柱时，不能通过柱孔的大分子无法进入孔中，并迅速通过周围的空隙从柱中离开，而小分子相对较慢地穿过柱的孔并离开柱。该方法通常用于脱盐以进行缓冲液交换、分离以进行纯化，或者根据溶质大小确定分子量。

在本发明中，通过将与细胞外囊泡特异性结合的探针与含有细胞外囊泡的各种样品一起温育来形成细胞外囊泡-探针复合物，使细胞外囊泡-探针复合物通过尺寸排阻色谱柱，从而迅速且容易地分级该复合物和游离探针，并且然后将由此分离的洗脱液进行下一步分析，从而轻松有效地定量细胞外囊泡，并分析细胞外囊泡的成分。

如本文所使用的，术语“细胞外囊泡”统指衍生自古细菌(archaea)、原核生物(prokarya)或真核生物(eukarya)的细胞的生物纳米颗粒，并且其实例可包括外泌体(exosomes)、argosomes、dexosomes、核外粒体(ectosomes)、exovesicles、oncosomes、prominosomes、prostasomes、tolerosomes、微粒(microparticles)、微囊泡(microvesicles)、纳米囊泡(nanovesicles)、blebbingvesicles、出芽囊泡(buddingvesicles)、外泌体样囊泡(exosome-likevesicles)、基质囊泡(matrixvesicles)、膜囊泡(membranevesicles)、脱落囊泡(sheddingvesicles)、膜颗粒(membraneparticles)、脱落微囊泡(sheddingmicrovesicles)、membraneblebs、epididimosomes、promininosomes、texosomes或archeosomes，但不限于此。

图1示意性地示出了一种根据本发明的用于分析细胞外囊泡的方法。

该根据本发明的用于分析细胞外囊泡的方法包括将探针与含有细胞外囊泡的样品混合，之后进行反应的步骤，每个探针均包含：与细胞外囊泡的成分特异性结合的结合部分；以及可检测的信号部分(步骤(a))。

如本文所使用的，术语“探针”是指与构成细胞外囊泡的成分特异性结合且可使用光谱分析法、物理化学分析法、量子化学分析法、酵素分析法等进行检测和分析的物质。

在本发明中，该探针可以是(i)单一物质，其包含：与细胞外囊泡的成分特异性结合的结合部分；以及可检测的信号部分，或者是(ii)复合物质，其中含有至少一个可分析的信号部分的物质与含有与细胞外囊泡的成分特异性结合的结合部分的物质结合。

细胞外囊泡被脂质双分子层包围，并且由衍生自母细胞的物质组成，例如蛋白质、脂质、核酸和氨基酸，它们分布在细胞外囊泡的膜表面上、细胞外囊泡的表面中，或者在细胞外囊泡中。在本发明中，探针的结合部分与选自由细胞外囊泡的膜表面成分、细胞外囊泡的膜成分以及细胞外囊泡的内部成分所构成的组的至少一种成分特异性结合。

探针可选自由蛋白质、抗体、抗体衍生物质、肽、核酸、核酸-氨基酸复合物、酶、酶底物、化学配体及其化合物所构成的组，它们各自与构成细胞外囊泡的至少一种成分特异性结合，但不限于此。探针可以是不仅与细胞外囊泡的成分特异性结合，而且在检测步骤中可检测的物质。在本发明的示例中，使用的是用于细胞外囊泡的内部成分酯酶的底物之一vpd450或cfda-se。此类底物不仅与细胞外囊泡中的酯酶特异性结合，而且还可以通过酶活性转化为荧光物质，从而无需任何单独的标记就可以检测荧光信号。

除了与构成细胞外囊泡的至少一种成分特异性结合的物质以外，本发明的探针还可包含可检测的信号部分。探针的信号部分可以是选自由荧光物质、酶底物、酶、蛋白质、肽、核酸、生物素、金属和放射性同位素所构成的组的至少一种。根据本发明的示例，使用通过将荧光标记附着于识别细胞外囊泡的膜表面蛋白的抗体而获得的探针。

如本文所使用的，术语“样品”包括含有细胞外囊泡、组织样品等的生物样品或细胞培养物，并且特别地，该样品可以是选自由哺乳动物细胞培养基、细菌细胞培养基、酵母培养基、组织提取物、癌症组织、血清、血浆、唾液、泪液、房水、汗液、尿液、粪便、脑脊髓液(csf)、腹水、羊水、精液、乳汁、灰尘、淡水、海水、土壤和发酵食品所构成的组的至少一种。

根据本发明的用于分析细胞外囊泡的方法包括通过尺寸排阻色谱柱注入混合样品，之后进行显影的步骤(步骤(b))。

如本文所使用的，术语“色谱柱”是指填充有用于尺寸排阻色谱法中的多孔固定相单元，其中，固定相是指具有各种尺寸的孔用于按分子量分级分离物质的颗粒。通过样品中存在的分子的分子大小进行分离的分离度取决于固定相中存在的孔的大小。例如，固定相中存在的大孔可有效分离较大的分子，而较小的分子则无需分离即可洗脱。然而，存在于固定相中的小孔导致大分子的洗脱度低，但是对于分离不小于预定尺寸且不大于预定尺寸的分子可能是有效的。因此，通常考虑到样品中待分离的分子大小和杂质大小，选择具有此类孔径的固定相，以提供最佳分离效率。在尺寸排阻色谱法中使用最广泛的凝胶是琼脂糖凝胶(gehealthcare)、superose凝胶(gehealthcare)、sephadex凝胶(pharmacia)、bio-gelp凝胶(bio-rad)和凝胶(基于硅胶，sigma)。在本发明的示例中，使用具有此类孔径以将细胞外囊泡作为纳米颗粒与各种尺寸的蛋白分离的sephacryls500，但不限于此。本发明的尺寸排阻色谱法的开发以泵送方式、旋转方式或重力方式进行，但不限于此。

根据本发明的分析细胞外囊泡的方法包括从显影样品中检测细胞外囊泡-探针复合物和游离探针的步骤(步骤(c))。

在本发明的检测步骤中，检测从尺寸排阻色谱分离的细胞外囊泡-探针复合物以及未与细胞外囊泡结合的游离探针，从而获得所需的分析结果。

本发明的检测步骤可包括通过观察预定波长下的吸收色谱图而定量细胞外囊泡的步骤。在本发明中，该预定波长可以是选自200nm至800nm范围内的至少一个值。在本发明中，该预定波长可以是在330nm至450nm范围内的至少一个波长，或者为230nm、260nm或280nm的波长，但不限于此。

本发明的检测步骤可包括通过检测探针的信号部分而定量探针的步骤。具体地，在检测探针的信号部分的步骤中，可以根据探针信号部分的种类来选择适当的检测和分析方法，并且可以从由光谱分析法(吸收、荧光、散射或放射)、物理化学分析法、量子化学分析法、酵素分析法、生物素分析法和核酸分析法所构成的组选择适当的检测和分析方法，但不限于此。

根据探针信号部分的性质，本发明的探针检测步骤包括直接分析或间接分析。在可以根据探针的光波长进行直接光谱分析的情况下，可以通过检测探针的荧光信号、吸收信号、散射信号、发射信号或放射性信号来进行分析。在探针的信号部分需要进行额外处理的情况下，可以通过利用生物素分析、抗体分析、酶分析、聚合酶链反应(pcr)分析等进行间接分析。

本发明还提供了一种通过从样品中分离细胞外囊泡-探针复合物，然后对囊泡-探针复合物进行分析而分析细胞外囊泡的方法。

根据本发明的用于分析细胞外囊泡的方法包括将探针和含细胞外囊泡的样品混合，之后进行反应的步骤，每个探针均包含：与细胞外囊泡的成分特异性结合的结合部分；以及可检测的信号部分(步骤(a))；以及通过尺寸排阻色谱柱注入混合样品，之后显影的步骤(步骤(b))。

如上所述，对本发明的探针、样品或尺寸排阻色谱法进行了详细描述。

根据本发明的用于分析细胞外囊泡的方法包括将细胞外囊泡-探针复合物从尺寸排阻色谱柱分离的方法(步骤(c))。

在本发明的细胞外囊泡-探针复合物分离步骤中，利用了尺寸排阻色谱法的尺寸特异性分级能力。当样品通过尺寸排阻色谱柱时，样品中包含的细胞外囊泡和其他杂质将按尺寸顺序和时间顺序进行洗脱。在使用具有此类孔径的固定相以将细胞外囊泡作为纳米颗粒与各种大小的蛋白质分离的情况下，由于细胞外囊泡的分子大小为1,000kda或更大，大于游离探针或其他杂质，所以细胞外囊泡的洗脱速度相对较快。在本发明中，一些与样品混合的探针特异性结合以形成复合物，而其他探针则仍然作为不与细胞外囊泡结合的游离探针。与游离探针相比，具有相对大尺寸的细胞外囊泡-探针复合物被快速洗脱。每种物质的洗脱时间取决于多孔固定相的大小、孔的孔径、色谱柱的长度、流动相的流速等，并且该物质会在相同条件下，在特定时间从色谱柱中洗脱出来。

根据本发明的用于分析细胞外囊泡的方法包括从分离的细胞外囊泡-探针复合物检测探针的步骤(步骤(d))。

对本发明的检测步骤的详细描述如上所述。

在本发明的检测步骤中，可以进行细胞外囊泡的定量分析以及与细胞外囊泡结合的探针的定量分析，并根据探针的种类分析对细胞外囊泡的特异性或亲和力进行分析，并以此用于评估探针的性能。

有益效果

本发明的用于分析细胞外囊泡的方法利用尺寸排阻色谱法的尺寸特异性分级能力以及与细胞外囊泡特异性结合的探针的特征，并且本发明的方法可加速和促进样品中包含的细胞外囊泡的定量分析、细胞外囊泡的物理化学分析、细胞外囊泡中所含成分的种类和量的分析，以及探针对细胞外囊泡成分的特异性和亲和力的分析。此外，本发明的分析方法可以准确地分析样品中的细胞外囊泡，而无需对样品进行纯化或预处理，并且可以根据探针的种类简单而准确地分析细胞外囊泡的成分，从而可以利用细胞外囊泡提高诊断效率。此外，通过利用探针的特异性和亲和力分析，本发明的分析方法可以用于细胞外囊泡特异性抗体筛选、蛋白质筛选、化学物质筛选等。

附图说明

图1是根据本发明实施方案的用于分析细胞外囊泡的方法的示意图。

图2是描绘了根据本发明实例的从结直肠癌细胞系sw480中分离参考细胞外囊泡以及分离结果的示意图。

图3示出了根据本发明实例的确认荧光物质标记的小鼠抗体(正常小鼠igg)与参考细胞外囊泡的结合情况的uv(a)和荧光(b)色谱图。

图4示出了根据本发明实例的确认荧光物质标记的cd63抗体(抗cd63抗体)与参考细胞外囊泡的结合情况的uv(a)和荧光(b)色谱图。

图5示出了根据本发明实例的确认荧光物质标记的cd81抗体(抗cd81抗体)与参考细胞外囊泡的结合情况的uv(a)和荧光(b)色谱图。

图6示出了根据本发明实例的确认荧光标记的cd63抗体在参考细胞外囊泡中的特异性的荧光色谱图。

图7示出了根据本发明实例的确认cd81细胞外囊泡标志物在具有不同来源的细胞外囊泡中的表达谱的uv(a)和荧光(b)色谱图。

图8示出了分析肿瘤坏死因子α(tnfα)对从结直肠癌细胞释放的细胞外囊泡的icam1蛋白表达的影响的uv(a)和荧光(b和c)色谱图。

图9示出了根据本发明实例的通过使用荧光标记的cd63抗体从结直肠癌细胞培养物中确认细胞外囊泡(而无需单独分离细胞外囊泡)的荧光色谱图。

图10示出了根据本发明实例的通过使用荧光标记的cd81抗体从结直肠癌细胞培养物中确认细胞外囊泡(而无需单独分离细胞外囊泡)的uv(a)和荧光(b)色谱图。

图11示出了根据本发明实例的通过使用荧光标记的cd81抗体在不同培养时间确认在来自结直肠癌细胞培养物的样品中的细胞外囊泡(而无需单独分离细胞外囊泡)的纳米颗粒浓度(a)、uv(b)和荧光(c)色谱图的分析结果。

图12示出了根据本发明实例描绘了通过使用膜渗透性紫色增生染料450(vpd450)对细胞外囊泡进行分析的uv(a)和荧光(b和c)色谱图，该膜渗透性紫增生染料通过酯酶活性和参考细胞外囊泡中的酯酶活性显示荧光。

图13示出了根据本发明实例通过利用细胞外囊泡中的酯酶活性以及通过酯酶活性显示出荧光的膜渗透性紫增生染料450(vpd450)在来自结直肠癌细胞培养物的样品中细胞外囊泡(而无需分离细胞外囊泡)的分析结果的uv(b)和荧光(c)色谱图。

图14示出了根据本发明实例通过利用通过酯酶活性显示出荧光的膜渗透性紫增生染料450(vpd450)和基于旋转的尺寸排阻色谱法的荧光物质结合的参考细胞外囊泡的uv和荧光色谱分析结果(b)。

图15示出了根据本发明实例通过利用通过酯酶活性显示荧光的膜渗透性羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(cfda-se)以及基于旋转的尺寸排阻色谱法的荧光物质结合的参考细胞外囊泡的uv和荧光色谱分析结果(b)。

图16示出了根据本发明实例通过与生物素-胆固醇一起温育的参考细胞外囊泡的基于旋转的尺寸排阻色谱法分离的生物素-胆固醇-细胞外囊泡复合物的定量分析结果。

图17示出了通过与生物素-胆固醇一起温育的结直肠癌细胞培养物的基于旋转的尺寸排阻色谱法分离的生物素-胆固醇-细胞外囊泡复合物的定量分析结果。

图18示出了通过与生物素-胆固醇一起温育的人尿液(b)和人血清(c)的基于旋转的尺寸排阻色谱法分离的生物素-胆固醇-细胞外囊泡复合物的定量分析结果。

图19示出了根据本发明实例通过对用dil(亲脂性染料)温育的参考细胞外囊泡进行hplc分析而获得的荧光色谱图。

图20示出了根据本发明的实例对用dil(亲脂性染料)温育的衍生自大肠杆菌(e.coli)的细胞外囊泡进行hplc分析而获得的荧光色谱图。

实施例

在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅意在说明本发明，并且对于本领域技术人员而言明显的是，本发明的范围不解释为局限于这些实施例。

实施例1：参考细胞外囊泡的纯化和分析

将结直肠癌细胞系sw480培养基以500×g离心10分钟，并以2,000×g离心20分钟以除去沉淀物。为了初步纯化和沉淀上清液中存在的细胞外囊泡，向上清液中添加聚乙二醇溶液(8.4％聚乙二醇6000、250mmnacl、20mmhepes、ph7.4)，在冰箱中保存16小时，然后以12,000×g离心30分钟以收集沉淀的细胞外囊泡，然后将其溶于hepes缓冲盐水(20mmhepes、150mmnacl、ph7.4)中。

为了利用密度和浮力对细胞外囊泡进行二次纯化，将样品以200,000×g进行30％-20％-5％optiprep浮力密度梯度超速离心2小时。超速离心后，收获具有与细胞外囊泡相等密度(1.08-1.12g/ml)的区域。为了对该纯化的细胞外囊泡进行第三次纯化，利用高效液相色谱(hplc)将该区域注射到填充有sephacryls500的柱(10x100mm)中，通过分子尺寸排阻色谱法进行纯化而获得最终的细胞外囊泡。参考细胞外囊泡的分离方案在图2a中示出。

从浮力密度梯度超速离心后获得的样品表面收获十个区域级分作为二次纯化方法，并通过蛋白免疫印迹法对细胞外囊泡标志物(alix、cd9、cd81和cd63)在各级分中的分布进行了研究。结果示于图2b中。利用透射电子显微镜(tem)对最终通过三次纯化方法分离的参考细胞外囊泡进行观察，结果确定了纯化的参考细胞外囊泡的形状和尺寸(约50-200nm)(图2c)。

实施例2：使用泵式尺寸排阻色谱法和荧光标记的抗体分析参考细胞外囊泡

为了确定细胞外囊泡的成分可通过利用尺寸排阻色谱法的尺寸特异性分级能力和定量识别细胞外囊泡成分的各种探针而进行定量分析，进行了以下测试。

2-1.荧光标记的小鼠抗体(正常小鼠igg)

将纯化的参考细胞外囊泡与荧光标记的小鼠抗体(正常小鼠igg)混合，然后在37℃温育30分钟，之后将混合物注射入填充有sephacryls500的柱中，并利用hplc系统进行显影，并对280nm的吸收色谱图(图3a)和荧光色谱图(图3b)进行分析。

吸收色谱图的结果证实，在6.5分钟时检测到参考细胞外囊泡，在14.5分钟时检测到抗体。在荧光色谱图中，在14.5分钟处检测到荧光标记的抗体的荧光带，但未观察到对应于6.5分钟级分的参考细胞外囊泡的荧光带。结果表明，在相应条件下，参考细胞外囊泡与小鼠抗体之间没有非特异性结合，并且通过尺寸排阻色谱法有效地分离和洗脱了参考细胞外囊泡与小鼠抗体的混合物。

2-2.荧光标记的抗cd63和抗cd81抗体(acd63和acd81抗体)

将不同量的纯化的参考细胞外囊泡与荧光标记的抗cd63抗体(acd63抗体)混合(该抗体识别cd63(细胞外囊泡的膜表面蛋白))，然后在37℃温育30分钟，之后将混合物注射入填充有sephacryls500的柱中，并利用hplc系统进行显影，之后对280nm的吸收色谱图(图4a)和荧光色谱图(图4b)进行分析。

此外，将不同量的纯化的参考细胞外囊泡与荧光标记的抗cd81抗体(acd81抗体)混合(该抗体识别cd81(细胞外囊泡的另一种膜表面蛋白))，然后在与上述相同的条件下通过尺寸排阻色谱法使混合物显影，然后对280nm的吸收色谱图(图5a)和荧光色谱图(图5b)进行分析。

结果证实，在相应的柱中，在6.5分钟处检测到参考细胞外囊泡的280nm吸收带，并在相同的检测时间观察到荧光带，并且检测到的带的面积与注射的参考细胞外囊泡的量高度相关。然而，在14.5分钟时检测到的荧光标记的游离抗体的荧光带面积与注射的参考细胞外囊泡的量成反比降低。结果表明，与参考细胞外囊泡混合的抗体特异性识别细胞外囊泡的成分(cd63和cd81)(分别与cd63和cd81结合)，从而形成“细胞外囊泡-抗体复合物”，并且分子量相对小的荧光标记抗体(在14.5分钟检测到)与对应于大分子的细胞外囊泡一起显影，从而在细胞外囊泡的检测时间(6.5分钟)处检测到荧光带。此外，结果表明，在荧光标记的游离抗体的检测时间检测到的荧光带面积反映了游离抗体的量，其对应于与样品混合的抗体总量减去与细胞外囊泡结合的抗体量。

2-3.抗cd63抗体的竞争性结合

为了研究当荧光标记的抗cd63抗体特异性识别参考细胞外囊泡中存在的cd63以形成复合物时，荧光标记是否对特异性结合产生影响，将细胞外囊泡与荧光标记的抗cd63抗体和未标记的抗cd63抗体混合，然后进行温育。具体地，将通过尺寸排阻色谱法对与荧光标记的抗cd63抗体混合的一组参考细胞外囊泡与以1:10的比率与荧光标记的抗cd63抗体和未标记的抗cd63抗体进行混合的一组参考细胞外囊泡之间的荧光色谱图进行比较。

结果证实，在进一步添加过量的荧光未标记的抗cd63抗体的组中，细胞外囊泡-抗体复合物的荧光带显著降低(图6)。这些结果表明，过量的荧光未标记的抗cd63抗体与细胞外囊泡的cd63结合，从而抑制了荧光标记的抗cd63抗体的结合，进而导致与细胞外囊泡结合的荧光标记的抗cd63抗体的量显著降低，这表明细胞外囊泡与抗cd63抗体之间的结合是非常特异性的，并且荧光标记对抗cd63抗体的功能没有影响。

2-4.从不同种类母细胞释放的细胞外囊泡和荧光标记的抗cd81抗体

通过将等量的从不同种类的母细胞(sw480和hmec1)释放的细胞外囊泡与等量的荧光标记的抗cd81抗体混合，利用尺寸排阻色谱法通过280nm的吸收色谱图(图7a)和荧光色谱图(图7b)对各种细胞外囊泡中cd81蛋白的表达谱进行分析。

结果表明，在相应的柱中，在6.5分钟处检测到的280nm吸收带的面积与相应类型细胞外囊泡的相同，但相应类型的细胞外囊泡的复合物的荧光带面积却与在同一检测时间(6.5分钟)处检测到的抗cd81抗体的荧光带面积不同。衍生自hmec1细胞的细胞外囊泡中的荧光显著低于衍生自sw480结直肠癌细胞的细胞外囊泡，并且衍生自hmec1细胞的细胞外囊泡中8.5分钟时游离抗体的荧光带面积更高。原因是每单位样品中细胞外囊泡的量取决于母细胞的种类，这表明通过本发明的分析方法，在对几种细胞外囊泡进行分析时，可以迅速确定每单位细胞外囊泡中各成分的相对量。

2-5.根据用或不用tnfα处理的细胞外囊泡的成分变化

本发明的方法用于分析tnfα对从结直肠癌细胞释放的细胞外囊泡的成分变化的影响。具体而言，将培养时的结直肠癌细胞分为经tnfα处理24小时的组(tnfα+)和未经tnfα处理的组(tnfα-)，并通过常规方法对各细胞培养基中的细胞外囊泡进行纯化。将各组中纯化的细胞外囊泡与荧光(fitc)标记的抗cd81抗体和荧光(pe)标记的抗icam1抗体混合，然后进行温育，之后将混合物注射入尺寸排阻色谱柱中，在尺寸排阻色谱柱中显影，并对280nm的吸收色谱图(图8a)和荧光色谱图(图8b和8c)进行分析。

结果证实，在相应的柱中，在各种情况下，在3.6分钟处检测到的细胞外囊泡的cd81的280nm吸收带(a)的面积和荧光带(b)的面积相似，但在同一检测时间(3.6分钟)处检测到的icam1的荧光带(c)在tnfα+组中比在tnfα-组中的更显著增加。结果表明，经tnfα处理后，细胞外囊泡中cd81蛋白的量变化不大，而icam1蛋白的量显著增加。结果表明，由细胞条件、环境或外部因素引起的细胞生理变化导致从细胞甚至从均质细胞释放的细胞外囊泡的成分发生变化，并且通过本发明的方法可以很容易地对这种变化进行分析。

简而言之，本分析方法可以简单且迅速地用于样品中细胞外囊泡总量和细胞外囊泡成分的分析，以及抗体和配体对细胞外囊泡成分的特异性和亲和力的分析。

实施例3：使用泵式尺寸排阻色谱法和荧光标记的抗体分析细胞培养物中的细胞外囊泡

3-1.荧光标记的抗c63抗体

为了使用本发明的分析方法对细胞培养物中细胞外囊泡的量或成分进行分析，将sw480结直肠癌细胞在rpmi培养基中培养24小时，以收集细胞培养物。将一组不含细胞培养物并与荧光标记的抗cd63抗体混合的rpmi培养基和一组与荧光标记的抗cd63抗体混合的结直肠癌细胞培养物在37℃温育30分钟，并注射到tsk6000hplc柱中，之后利用hplc系统进行显影，并对荧光色谱图进行分析。

结果，如图9所示，在该组与荧光标记的抗cd63抗体混合的rpmi培养基中只观察到了在22分钟处检测到的游离抗体的荧光带，而在该组与荧光标记的抗cd63抗体混合的结直肠癌细胞培养物中在17分钟处检测到了其他荧光带并且在22分钟处检测到了游离抗体的荧光带。此外，在含有结直肠癌细胞培养物的样品中，在22分钟处检测到的荧光带面积约为该组与荧光标记的抗cd63抗体混合的rpim培养基中荧光带面积的50％。这些结果表明，约50％的荧光标记的抗cd63抗体与细胞培养物中的细胞外囊泡的cd63蛋白特异性结合，形成“细胞外囊泡-抗体复合物”，因此，此类荧光标记的抗cd63抗体与细胞外囊泡一起显影，产生了17分钟处的荧光带。因此可见，通过使用该分析方法，即使不从细胞培养物中单独纯化细胞外囊泡，也可以对细胞培养物中细胞外囊泡的成分进行分析。

3-2.荧光标记的抗c81抗体

与上述3-1类似，将结直肠癌细胞培养物与荧光标记的抗cd81抗体混合，然后在37℃温育30分钟，之后将混合物注射到sephacryls500柱中，利用hplc系统进行显影，并对280nm的吸收色谱图(图10a)和荧光色谱图(图10b)进行分析。

结果，在相应的柱中于3.5分钟处检测到280nm的吸收带和荧光带。这些结果证实，细胞外囊泡表达cd81蛋白，这表明可以在无需对细胞外囊泡进行单独纯化的情况下，对样品中细胞外囊泡的成分进行分析。

3-3.随培养时间的推移对细胞外囊泡的分析

为了研究细胞生长过程中释放的细胞外囊泡的情况，将不同培养时间的各个结直肠癌细胞培养物与等量的荧光标记的抗cd81抗体混合，然后在37℃温育30分钟，之后将混合物注射到sephacryls500柱中，并利用hplc系统进行显影。对于各个细胞培养物而言，对纳米颗粒浓度(图11a)、通过尺寸排阻色谱的280nm吸收色谱图(图11b)和荧光色谱图(图11c)进行了分析。

通过纳米颗粒浓度分析的结果表明，随着结直肠癌细胞培养时间的增加，细胞培养物中纳米颗粒浓度提高。尺寸排阻色谱法的结果证实，随着结直肠癌细胞培养时间的增加，在洗脱细胞外囊泡的3.6分钟处cd81抗体的280nm吸收带和荧光带均增加，这表明培养时间与细胞培养物中纳米颗粒浓度的增加具有高度相关性。结果表明，本发明的方法可用于分析样品中细胞外囊泡的相对量和成分，而无需单独纯化细胞外囊泡。

实施例4：使用泵式尺寸排阻色谱法和膜渗透性酶底物分析参考细胞外囊泡

在本发明的方法中，为了研究通过使用识别细胞外囊泡的内部成分的探针或酶来定量分析细胞外囊泡成分的可能性，使用了vpd450，其中vpd450是酯酶(细胞外囊泡内存在的一种酶)的底物，具有膜渗透性性质，并且通过酶活性会转化为荧光物质。具体而言，将纯化的参考细胞外囊泡、荧光标记的抗cd81抗体和不同浓度的vdp450混合，在37℃温育30分钟，注射到sephacryls500柱中，利用hplc系统显影，并对280nm的吸收色谱图(图12a)和荧光色谱图(图12b和12c)进行分析。

通过280nm的吸收带的结果证实了在相应柱上3.5分钟处检测到参考细胞外囊泡，并通过荧光色谱图的结果证实了，在相同的洗脱时间观察到抗cd81抗体的荧光带和vpd450的荧光带。因此可以看出，参考细胞外囊泡同时表达cd81蛋白和酯酶。还可以看出，vpd450的荧光带面积与vpd450的浓度成正比，并且随着vpd450浓度的增加，荧光酶活性产物在细胞外囊泡中积聚。同时，可以看出，通过自然水解产生的vpd450的荧光产物(峰值在图12c中稍后位置出现)具有较小的分子尺寸，因此通过尺寸排阻色谱法得以清楚地区分。

实施例5:使用泵式尺寸排阻色谱法和膜渗透性酶底物分析细胞培养物中的细胞外囊泡

为了证明利用实施例4中证实的针对存在于细胞外囊泡内的酶的底物可以在甚至无需对细胞外囊泡进行额外纯化的情况下对生物样品中的细胞外囊泡进行分析，使用细胞培养物进行了测试。具体而言，将sw480结直肠癌细胞培养物和膜渗透性vdp450混合，在37℃温育不同的时间，注射到sephacryls500柱中，利用hplc系统进行显影，并对280nm的吸收色谱图(图13a)和荧光色谱图(图13b)进行分析。

结果，在相应的柱中，与温育时间无关，在3.5分钟时检测到的参考细胞外囊泡的280nm吸收带的面积是恒定的，但是荧光带随温育时间而增加。原因是，细胞外囊泡内的酯酶将流入细胞外囊泡的vpd450转化为荧光物质(与温育时间成正比)，并且转化的荧光物质在细胞外囊泡内部积聚。可以看出，若底物的量或温育时间固定，则即使不对细胞外囊泡进行纯化，也可以将上述方法用于分析生物样品中细胞外囊泡的总量。

实施例6：使用基于旋转的尺寸排阻色谱法和膜渗透性酶底物分析参考细胞外囊泡

6-1.参考细胞外囊泡-荧光vpd450复合物

在使用膜渗透性酶底物分析细胞外囊泡的方法中，如图14a的示意图中所示，细胞外囊泡-荧光vpd450复合物从不与细胞外囊泡反应的物质中分离，然后对分离出的复合物进行分析。具体而言，将参考细胞外囊泡与膜渗透性底物vpd450混合，然后进行温育，之后将混合物装入基于旋转的sephacryls500柱中，然后离心，从而收集洗脱液。将洗脱的细胞外囊泡-荧光vpd450复合物注射到sephacryls500柱中，利用hplc系统进行显影，并分析280nm的吸收色谱图和荧光色谱图(图14b)。

结果，对于不与vpd450反应的参考细胞外囊泡，仅在3.5分钟处检测到280nm吸收带，而在相同时间未检测到荧光带，但是对于使用基于旋转的尺寸排阻色谱法进行预处理的样品，在3.5分钟处检测到280nm吸收带和强vpd450荧光带。结果表明，通过预处理有效地去除了不与细胞外囊泡反应的小分子物质。

6-2.参考细胞外囊泡-cfda-se复合物

如图15a的示意图中所示，将参考细胞外囊泡与另一种酯酶底物cfda-se混合，然后进行温育，从而获得溶液，然后通过以上6-1中所示的方法对该溶液进行预处理，注射到sephacryls500柱中，利用hplc系统进行显影，并对280nm的吸收和荧光色谱图(图15b)进行分析。

结果，在相应的柱中，在3.5nm处检测到280nm的吸收带，在相同时间检测到荧光带，这表明cfda-se也按照与vpd450相同的机理渗透过膜，通过细胞外囊泡中酯酶的活性而变成荧光物质，并且该荧光物质在细胞外囊泡内积聚。

因此，通过利用包括分离细胞外囊泡步骤的方法，可以分析样品中细胞外囊泡的总量，并且可以通过提供纯化的探针-细胞外囊泡复合物，将该方法用于利用细胞外囊泡的各种追踪研究中。

实施例7：使用基于旋转的尺寸排阻色谱法和胆固醇探针(生物素化胆固醇)分析细胞外囊泡

为了确定细胞外囊泡的总量可以通过利用尺寸排阻色谱分析定量探针(与细胞外囊泡成分的脂质双分子层结合或插入到(贯穿细胞膜)细胞外囊泡成分的脂质双分子层)来确定，生物素-胆固醇用作探针。

具体地，如图16a的示意图中所示，将不同量的纯化参考细胞外囊泡与生物素-胆固醇混合，然后在37℃温育30分钟，之后为了去除不与细胞外囊泡结合的生物素-胆固醇，将各个混合物溶液装入基于旋转的sephacryls500柱中，然后以700xg离心5分钟，从而收集洗脱液。通过与上述相同的方法，将生物素-胆固醇单个组或参考细胞外囊泡单个组作为对照，装入柱中，然后旋转，从而收集洗脱液。为了定量洗脱液中的生物素，将洗脱液置于96孔板(微板)中，然后将样品中的物质吸附并固定在板上。此后，将板与链霉亲和素-过氧化物酶一起温育，然后洗涤，之后根据板上残留的过氧化物酶的活性测量化学发光(图16b)。

结果，在生物素-胆固醇单个组或参考细胞外囊泡单个组中几乎观察不到化学发光。结果表明，小分子量的生物素-胆固醇未从基于旋转的尺寸排阻色谱图中洗脱，这表明大分子量的细胞外囊泡从基于旋转的尺寸排阻色谱柱上洗脱，与图15的结果相似，但是在洗脱的参考细胞外囊泡本身中不存在能够与链霉亲和素-过氧化物酶结合的生物素。另一方面，在将参考细胞外囊泡和生物素-胆固醇混合并温育的组中观察到高化学发光，并且化学发光的强度与参考细胞外囊泡的量成比地增加。这些结果表明，相对小分子量的生物素-胆固醇被插入到构成细胞外囊泡的脂质双分子层中，并且可以与大分子量的细胞外囊泡一起从基于旋转的尺寸排阻色谱柱上洗脱，并且生物素-胆固醇向脂质双分子层中的插入程度与细胞外囊泡的量成正比。

实施例8：使用基于旋转的尺寸排阻色谱法和胆固醇探针分析结直肠癌细胞培养物中的细胞外囊泡

实施例7中证明，通过基于旋转的尺寸排阻色谱法预处理，仅生物素-胆固醇-细胞外囊泡复合物可以从参考细胞外囊泡和生物素-胆固醇的混合物中有效分离。使用sw480结直肠癌细胞培养物和生物素-胆固醇，研究细胞培养物中细胞外囊泡的总量是否可以在无需通过上述方法对细胞外囊泡进行纯化的情况下进行分析。具体地，如图17a的示意图中所示，将不同浓度的sw480结直肠癌细胞培养物与生物素-胆固醇混合，然后在37℃温育30分钟。之后，为了去除不与样品中的细胞外囊泡结合的生物素-胆固醇，将各混合物溶液装入基于旋转的sephacryls500柱中，然后以700xg离心5分钟，从而收集洗脱液。通过与上述相同的方法，将生物素-胆固醇单个组或结直肠癌细胞培养物单个组作为对照，装入柱中，然后旋转，从而收集洗脱液。为了定量洗脱液中的生物素，将洗脱液置于96孔板(微板)中，然后将样品中的物质吸附并固定在板上。此后，将板与链霉亲和素-过氧化物酶一起温育，然后洗涤，之后根据板上残留的过氧化物酶的活性测量化学发光(图17b)。

结果，在生物素-胆固醇单个组和结直肠癌细胞培养物单个组中观察到化学发光非常低或不存在，但是在结直肠癌细胞培养物和生物素-胆固醇混合并温育的组中观察到高化学发光。这些结果证明，生物素-胆固醇分子被插入细胞培养物中的细胞外囊泡的脂质双分子层中，并且可以与细胞外囊泡一起从基于旋转的预处理尺寸排阻色谱柱中洗脱。

实施例9：利用基于旋转的尺寸排阻色谱法和胆固醇探针分析体液中的细胞外囊泡

如实施例8所证实的，无需对细胞外囊泡进行纯化就可以分析细胞培养物中的细胞外囊泡，并将上述方法应用于人体体液。具体地，如图18a的示意图中所示，将人尿液或人血清与生物素-胆固醇混合，然后在37℃温育30分钟。为了去除不与样品中的细胞外囊泡结合的生物素-胆固醇，将混合物溶液装入基于旋转的sephacryls500柱中，然后以700xg离心5分钟，从而收集洗脱液。通过与上述相同的方法，将生物素-胆固醇单个组或生物样品单个组作为对照，装入柱中，然后旋转，从而收集洗脱液。为了定量洗脱液中的生物素，将洗脱液置于96孔板(微板)中，然后将样品中的物质吸附并固定在板上。此后，将板与链霉亲和素-过氧化物酶一起温育，然后洗涤，之后根据板上残留的过氧化物酶的活性测量化学发光(图18b和18c)。

结果，在生物素-胆固醇单个组和结直肠癌细胞培养物单个组中观察到化学发光非常低或不存在，但是在生物样品(尿液或血清)和生物素-胆固醇进行混合和温育的组中观察到高化学发光。结果表明，生物素-胆固醇分子被插入到生物样品中细胞外囊泡的脂质双分子层中，并且可以与细胞外囊泡一起从基于旋转的预处理尺寸排阻色谱柱上洗脱，这表明上述方法可用于测量各种体液中存在的细胞外囊泡总量。

实施例10：使用基于旋转的尺寸排阻色谱法和亲脂性探针(dil)分析参考细胞外囊泡

使用荧光标记的亲脂性dil代替胆固醇作为结合或插入脂质双分子层(作为细胞外囊泡成分之一)的探针进行了进一步的测试。具体地，如图19a的示意图中所示，将荧光标记的亲脂性dil单个组或参考细胞外囊泡与荧光标记的亲脂性dil混合组在37℃温育30分钟，然后，为了除去不与细胞外囊泡结合的荧光标记的亲脂性dil，将各混合物溶液装入基于旋转的sephacryls500柱中，然后以700xg离心5分钟，从而收集洗脱液。之后，将洗脱液注射到sephacryls500柱中，利用hplc系统进行显影，并分析280nm的吸收色谱图和荧光色谱图(图19b)。

结果，小分子量荧光标记的亲脂性dil无法从基于旋转的尺寸排阻色谱柱上洗脱，因此未检测到荧光带，但在参考细胞外囊泡和荧光标记的亲脂性dil的混合组中在3.5分钟(其为细胞外囊泡的洗脱时间)时检测到高荧光带。结果表明，小分子量荧光标记的亲脂性dil被插入到细胞外囊泡的脂质双分子层中，并与细胞外囊泡一起从基于旋转的尺寸排阻色谱柱中洗脱出来。

实施例11:利用基于旋转的尺寸排阻色谱法和亲脂性探针(dil)分析衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡

通过将与实施例10相同的探针应用于衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡而进行分析。具体地，如图20a的示意图中所示，将荧光标记的亲脂性dil单个组或衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡与荧光标记的亲脂性dil的混合组在37℃温育30分钟，然后为了去除不与细胞外囊泡结合的荧光标记的亲脂性dil，将各混合物溶液装入基于旋转的sephacryls500柱中，之后以700xg离心5分钟，从而收集洗脱液。之后，将洗脱液注射到sephacryls500色谱柱中，并利用hplc系统进行显影，并对280nm的吸收色谱图和荧光色谱图(图20b)进行分析。

结果，小分子量荧光标记的亲脂性dil无法从基于旋转的尺寸排阻色谱柱上洗脱，因此未检测到荧光带，但在衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡与荧光标记的亲脂性dil的混合组中在3.5分钟(其为细胞外囊泡的洗脱时间)时检测到高荧光带。这些结果表明，小分子量的荧光标记的亲脂性dil被插入到细胞外囊泡的脂质双分子层中，并与细胞外囊泡一起从基于旋转的尺寸排阻色谱柱中洗脱。

因此，证实了衍生自细菌的细胞外囊泡也包含脂质双分子层，并且本分析方法可用于分析细胞外囊泡的总量以及细胞外囊泡的特性。