一种非诺贝特胆碱的检测方法与流程

本发明属于医药领域，涉及一种非诺贝特胆碱的检测方法，特别涉及一种非诺贝特胆碱的含量有关物质及残留溶剂的测定方法。
背景技术：
：非诺贝特胆碱缓释胶囊由abbvie公司于2008.12.15通过fda上市，商品名：trilipix，规格：45mg、135mg。非诺贝特胆碱是非诺贝特在体内的代谢产物非诺贝酸(fenofibricacid，2)和胆碱结合形成的复盐，在碱性条件下溶解度明显高于非诺贝特。可降低低密度脂蛋白(ldl)和甘油三酯水平，增加高密度脂蛋白(hdl)水平，也可与他汀类药物合用以改善高血脂症状。非诺贝特胆碱无药典标准，我们在总结各项技术研究指导原则的基础上对产品特有的具有专属性的检测项目残留溶剂检测、有关物质检测、含量测定检测开发了相应的方法，并进行了方法学验证，结果表明建立的方法精密度高、耐用性好，准确度好。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种非诺贝特胆碱的检测方法。本发明的方法能有效的对非诺贝特胆碱的质量进行控制，该方法具有精密度高、耐用性好，准确度好等特点。本发明所述的检测方法，主要包括：非诺贝特胆碱含量的测定，非诺贝特胆碱有关物质的检查，非诺贝特胆碱残留溶剂检查。本发明的检测方法，具体包括以下步骤：1、非诺贝特胆碱含量的测定：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相；测定法取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-水溶液振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加甲醇-水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取非诺贝酸对照品，同法测定，按外标法以峰面积计算，并将结果乘以1.3236，即得。其中，流动相为磷酸盐缓冲液-乙腈＝20-40：60-80。优选为，磷酸盐缓冲液-乙腈＝32：68。其中，流动相的ph值为2.5-3.5，优选的，ph值调节至3。其中，检测波长为250-350nm，优选的，检测波长为300nm。其中，流速：1.0-1.5ml/min，优选的流速为：1.0ml/min。2、非诺贝特胆碱有关物质的检查取本品适量，精密称定，加磷酸盐缓冲液-乙腈作为流动相，溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取杂质ⅰ(4'-氯-4-羟基二苯甲酮)对照品、非诺贝酸对照品、杂质c((3rs)-3-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]丁基-2-酮)对照品、非诺贝特对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml各约含1μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液，照含量测定项下的色谱条件进样20μl，记录色谱图，出峰顺序依次是杂质ⅰ、非诺贝酸、杂质c和非诺贝特，任一相邻峰的分离度应不小于2.0；另取对照溶液20μl注入液相色谱仪；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍，供试品溶液的色谱图中，如有与杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特峰保留时间一致的色谱峰，按校正后的峰面积计算，分别不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍；其他任一单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍。3、非诺贝特胆碱残留溶剂检查取本品约0.5g，精密称定，置顶空瓶中，加入溶剂振摇溶解，密封，作为供试品溶液；另取三氯甲烷、氯苯、二氯甲烷和异丙醇适量，精密称定，加入溶剂溶解并稀释制成分别含三氯甲烷、氯苯、二氯甲烷和异丙醇的混合溶液，摇匀，精密量取5ml，置于顶空瓶中，密封，作为对照品溶液；照残留溶剂测定法试验，以氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱；取对照品溶液顶空进样，各成分峰之间的分离度均应符合规定；再取供试品溶液和对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，均应符合规定。其中，溶剂选自：二甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺-水(5:1)、甲醇、10％甲醇溶液，优选溶剂为10％甲醇溶液。其中，载气流速：氮气，柱流速2.0ml/min，分流比20：1。柱温：30-50℃保持6-10分钟，以20-40℃/min的速率升温至200℃，保持4-8分钟。进样口温度：200℃检测器温度：250℃。顶空平衡温度70℃，平衡30分钟；优选的，载气流速：氮气，柱流速2.0ml/min，分流比20：1。柱温：40℃保持8分钟，以30℃/min的速率升温至200℃，保持5分钟。进样口温度：200℃检测器温度：250℃。顶空平衡温度70℃，平衡30分钟；进一步优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：1、非诺贝特胆碱含量的测定：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液(称取3.4g磷酸二氢钾溶于1000ml水中，用磷酸调节ph值至3.0)-乙腈(32：68)为流动相；检测波长为300nm，流速：1.0ml/min，理论板数按非诺贝酸峰计算不低于2500，拖尾因子不大于2.0。测定法取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-水(80：20)振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加甲醇-水(80：20)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取非诺贝酸对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，并将结果乘以1.3236，即得。2、非诺贝特胆碱有关物质的检查取本品适量，精密称定，加流动相磷酸盐缓冲液(称取3.4g磷酸二氢钾溶于1000ml水中，用磷酸调节ph值至3.0)-乙腈(32：68)溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取杂质ⅰ(4'-氯-4-羟基二苯甲酮)对照品、非诺贝酸对照品、杂质c((3rs)-3-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]丁基-2-酮)对照品、非诺贝特对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml各约含1μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液，照含量测定项下的色谱条件进样20μl，记录色谱图，出峰顺序依次是杂质ⅰ、非诺贝酸、杂质c和非诺贝特，任一相邻峰的分离度应不小于2.0；另取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的15％～20％；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍。供试品溶液的色谱图中，如有与杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特峰保留时间一致的色谱峰，按校正后的峰面积计算(分别乘以校正因子0.59、0.65和0.8)，分别不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)；其他任一单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)。3、非诺贝特胆碱残留溶剂检查取本品约0.5g，精密称定，置顶空瓶中，精密加10％的甲醇溶液5ml振摇溶解，密封，作为供试品溶液；另取三氯甲烷、氯苯、二氯甲烷和异丙醇适量，精密称定，加10％的甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中分别含三氯甲烷6μg、氯苯36μg、二氯甲烷60μg和异丙醇0.5mg的混合溶液，摇匀，精密量取5ml，置于顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。照残留溶剂测定法(中国药典2010年版二部附录ⅷp第二法)试验，以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相似)为固定液的毛细管色谱柱；初始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟30℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为70℃，平衡时间为30分钟。取对照品溶液顶空进样，各成分峰之间的分离度均应符合规定。再取供试品溶液和对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，均应符合规定。本发明的测定方法是经过筛选获得的，并经过系统的方法学验证，筛选验证过程如下：一、非诺贝特胆碱原料含量测定检测方法的优选1、色谱条件和系统适用性的选择含量测定过程中我们采用非诺贝酸作为非诺贝特胆碱和非诺贝特胆碱缓释胶囊含量测定用对照品，非诺贝酸不易溶于水，易溶于甲醇；非诺贝特胆碱易溶于水和甲醇；为防止第二步以水为稀释剂时非诺贝酸析出，我们对第二步稀释溶剂用水和甲醇水进行了同步对比；结果见下表：表1方法筛选1从上述结果可以看出，第二步以水作为稀释剂，非诺贝酸对照品会析出，造成自身浓度降低，导致非诺贝特胆碱含量偏高。同样样品在流动相流速为1.0ml/min和1.5ml/min时测定样品含量无差别，但1.0ml/min流速时主峰的理论板数较大些，并且考虑到1.5ml/min流速过大，对色谱柱损害较大，因此确定方法四为非诺贝特胆碱的含量测定色谱条件。一般情况下，一个品种的有关物质检查方法和含量测定方法一致，并且在试验的过程中我们发现，流动相的ph值对样品中不同成分的分离度影响较大，于是我们配制了几个已知杂质与样品的混合溶液，用不同ph值的流动相洗脱，流速设置为1.0ml/min，检测波长300nm，结果见下表：表2方法筛选2通过比较，发现ph2.5磷酸盐配制的流动相检测出的色谱图中相邻峰分离度较小，很难达到要求；则调整流动相中磷酸盐ph值至3.0，然后测试已知杂质与样品的混合溶液，发现各峰理论板数均较好，且分离度均大于2.0，杂质和主峰均有保留时间增大的趋势；继续调整流动相水箱ph值至3.5，测试样品与已知杂质的混合溶液，发现只出现一个大大的肩峰，而无其他峰出现，说明ph3.5的水相不适合测定非诺贝特胆碱。所以选择ph3.0磷酸盐-乙腈(32:68)作为本品的流动相。通过筛选，拟定如下方法：【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录vd)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液(称取3.4g磷酸二氢钾溶于1000ml水中，用磷酸调节ph值至3.0)-乙腈(32：68)为流动相；检测波长为300nm；理论板数按非诺贝酸峰计算不低于2500，拖尾因子不大于2.0。测定法取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-水(80：20)振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加甲醇-水(80：20)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取非诺贝酸对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，并将结果乘以1.3236，即得。2、线性关系精密称取非诺贝特胆碱(xs20140501批)25.40mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；从中分别精密量取(1)1ml、(2)1ml、(3)2ml、(4)10ml，(5)5ml，分别置(1)50ml、(2)10ml、(3)10ml、(4)25ml、(5)10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为5个供试品溶液，各精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见附图3.2.s.4.3-52～3.2.s.4.3-56。量取峰面积，以浓度对峰面积进行线性回归，得回归方程。测量结果见下表。表3线性关系试验结果非诺贝特胆碱含量测定标准曲线见图1。结论：非诺贝特胆碱在浓度0.01016mg/ml～0.254mg/ml范围内，线性关系良好。3、精密度试验经过进样精密度试验、重复性试验和中间精密度试验，结果表明用该方法测定非诺贝特胆碱含量，精密度良好。4、溶液稳定性试验非诺贝特胆碱对光敏感，我们考察非诺贝特胆碱溶液在避光和不避光条件下的稳定性，以考察样品放置过程中是否需要避光操作。试验结果表明，非诺贝特胆碱溶液在避光条件下和不避光条件下8小时内均比较稳定。5、回收率试验取非诺贝酸对照品制备对照品溶液，取非诺贝特胆碱(xs20140501批)约20mg(80％)、25mg(100％)、30mg(120％)，各三份，制备供试品溶液。精密量取9份供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按外标法计算回收率。结果见下表：表4回收率试验结果由结果可知，用该方法测定非诺贝特胆碱的含量，准确度高。6、耐用性试验考察流动相比例、检测波长、色谱仪型号、色谱柱四种变动因素对方法本身的干扰能力。精密称取非诺贝酸对照品、非诺贝特胆碱(xs20140501)适量，分别依法配制成每1ml约含0.1mg的溶液，作为对照品溶液和供试品溶液。标准条件为岛津lc-2010a型高效液相色谱仪、thermohypersilgoldc18型色谱柱，以ph3.0磷酸盐缓冲液-乙腈(32：68)为流动相。变动其中任一条件时其他条件不变。结果表明，色谱仪型号、流动相配比、检测波长、色谱柱品牌分别在相应范围内变化对含量测定结果无显著性影响，因此可用该方法测定非诺贝特胆碱含量。7、含量测定方法的确定与七批样品的检查以上几个试验表明，用该方法测定非诺贝特胆碱含量，准确度高，专属性强，故确定用该方法测定非诺贝特胆碱含量。根据确定的方法对非诺贝特胆碱三批工艺验证批样品与连续生产的四批中试样品进行含量测定，结果见下表。表5含量测定结果批号含量xs2014050199.3％xs2014050299.7％xs20140503100.0％zs20140601100.0％zs2014060299.5％zs2014070199.6％zs2014070299.8％结论：用建立的方法对7批样品进行检验，结果均符合规定。二、非诺贝特胆碱有关物质检查检测方法的优选非诺贝特胆碱无药典标准，根据杂质谱分析，其中应控制的杂质有起始物料对氯苯甲酸、苯甲醚，中间体杂质ⅰ、副产物非诺贝特和杂质c，并且使用到的起始物料胆碱溶液可能带入三甲胺和环氧乙烷，根据结构分析，苯甲醚、环氧乙烷和三甲胺需要用气相方法检测，而对氯苯甲酸、杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特均有共轭结构，可以使用液相方法检测。非诺贝特胆碱最大吸收波长为300nm，杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特三个杂质也在300nm处有较大吸收，而对氯苯甲酸在300nm波长处无吸收，则我们将这三个杂质订入有关物质项下，在300nm波长处进行检测，而将对氯苯甲酸另建方法进行控制。利用拟定的方法对样品及三个杂质进行了专属性、灵敏度、准确度和耐用性等方法学研究，保证这些杂质和样品在该检测条件下有效的检出。1、检测波长的确定取非诺贝特胆碱、杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特，分别用流动相溶解，并稀释制成每1ml各约含10μg的溶液，用紫外-可见分光光度计于400nm～200nm波长处进行扫描，非诺贝特胆碱在300nm波长处有最大吸收，杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特在300nm处有较大吸收，300nm可以作为本品有关物质检查的检测波长。2、样品浓度的确定本品含量测定溶液浓度为0.1mg/ml，一般有关物质溶液浓度为含量测定溶液浓度的2.5～5倍，我们暂定样品测定浓度为0.5mg/ml。杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特三个杂质限度按一般鉴定杂质来算，限度应为0.1％，方法学研究中将这几个杂质配制成浓度为0.5μg/ml的溶液，即0.1％进行试验。3、专属性试验3.1、定位试验在确定空白溶剂无干扰的前提下。称取杂质ⅰ、杂质c、非诺贝特适量，制备各杂质定位溶液，杂质ⅰ保留时间为4.8min，杂质c保留时间为7.2min，非诺贝特保留时间为16.3min。非诺贝特胆碱保留时间为5.1min。称取杂质ⅰ、杂质c、非诺贝特和非诺贝特胆碱各适量，制成混合溶液，杂质ⅰ保留时间为4.6min，非诺贝特胆碱保留时间为5.0min，杂质c保留时间为7.2min，非诺贝特保留时间为16.3min，各峰理论板数均远大于2500，各相邻峰的最小分离度为2.71，符合规定。3.2、破坏性试验强制降解试验是在强度较大的条件下，如用强光照射、高温、高湿、酸碱水解还有氧化还原的方法，加速对样品进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，来评估分析方法的有效性和适用性，并采用pda紫外检测器测定，进行峰纯度及物料平衡的考察。表6峰纯度考察(要求：峰匹配值大于950时，判断该峰是纯的)表7破坏性试验物料平衡结果通过以上考察，由试验结果可知，非诺贝特胆碱溶液在光照、氧化条件下均不稳定，在酸、碱、高温条件下比较稳定。强制降解产生的新的杂质与主峰完全分离，并且物料平衡均在95.0％～105.0％范围内，说明平衡良好，可用该方法测定本品的降解产物。为保证杂质的有效检出，结合破坏性试验结果和专属性试验中非诺贝特保留时间，拟定有关物质样品测定时记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍。4、检测限与定量限检测限和定量限检查结果表明用该色谱条件检测杂质ⅰ、非诺贝特胆碱、杂质c和非诺贝特这四种物质，灵敏度较好。表8试验结果5、线性关系对以下几个杂质检测范围内线性进行考察，杂质ⅰ在浓度0.0106μg/ml～0.638μg/ml范围内，非诺贝特胆碱在0.0159μg/ml～6.362μg/ml范围内，杂质c在浓度0.0156μg/ml～0.623μg/ml范围内，非诺贝特在浓度0.0374μg/ml～0.641μg/ml范围内，线性关系良好。表9线性关系试验结果6、溶液稳定性试验称取非诺贝特胆碱和三个杂质，配制成每1ml含有非诺贝特胆碱约0.5mg，三个杂质各约0.5μg的混合溶液，分成2份，分别于避光条件下和常态条件下放置8小时，分别于0小时、1小时、3小时、5小时和8小时取样检测，结果如下表：表10避光条件下溶液稳定性试验结论：混合溶液避光条件下放置8小时，各杂质峰与主峰峰面积的相对标准偏差均不大于2.0％，面积百分比均无变化，并且无新的杂质出现，说明该溶液避光条件下8小时内比较稳定。表11不避光条件下溶液稳定性试验结论：混合溶液不避光条件下放置8小时，非诺贝特胆碱峰面积变化不大，8小时内相对标准偏差不大于2.0％；非诺贝特峰面积和含量变化不大，但杂质ⅰ和杂质c有变大趋势。样品溶液中杂质随时间的增长而变多变大，说明非诺贝特胆碱溶液对光敏感，配制和放置过程中需要避光操作。7、校正因子为了考察杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特相对非诺贝特胆碱的校正因子，我们依照《hplc法校正因子研究中的几个问题》选择了三点法测定校正因子。制备适当的高(0.2％)、中(0.1％)、低(0.02％)三个水平浓度的三个杂质对照品和非诺贝特胆碱(1.0％)的混合溶液，分别进样测定，根据杂质峰峰面积和非诺贝特胆碱峰面积计算三个杂质的校正因子。结果见下表：表12校正因子的计算从以上数据可以看出，三个杂质的的相对校正因子均不在0.9～1.1范围内，依照《药品杂质分析指导原则》(中国药典2010年版二部附录ⅹⅸf)，可以用加校正因子的主成分自身对照法测定三个杂质含量。8、回收率试验(加样回收试验)考察非诺贝特胆碱中杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特在该色谱条件下的回收率。表13回收率试验结果结论：杂质回收率均在85.0％～110.0％之间，说明用该方法测定非诺贝特胆碱中杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特的含量，准确度高。9、耐用性试验考察不同仪器、流动相比例、流动相ph值、色谱柱、柱温、流动相流速、检测波长等变动因素对于方法本身的干扰能力。从试验结果对比可以看出，无论是检测波长在298nm～302nm范围内波动，或是柱温在25℃～35℃范围内波动，或是流速在0.8ml/min～1.2m/min范围内波动，或是流动相ph值在2.8～3.2范围内波动，或是流动相比例在(27:73)～(37:63)范围内波动，或是色谱柱由thermohypersilgoldc18型色谱柱更换为agilenthc-c18型色谱柱，对样品中杂质的测定无干扰，各成分峰的面积百分比变化均在±0.1％之内，并且各杂质的校正因子变化不大，说明用该条件测定非诺贝特胆碱的有关物质，耐用性良好。10、方法的确定依照杂质谱分析，本品涉及到的液相杂质有杂质ⅰ、杂质c、非诺贝特和对氯苯甲酸，对氯苯甲酸另外建立方法检测，而把杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特订入到有关物质项下。根据方法学研究确定的有关物质检查方法如下：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取杂质ⅰ(4'-氯-4-羟基二苯甲酮)对照品、非诺贝酸对照品、杂质c((3rs)-3-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]丁基-2-酮)对照品、非诺贝特对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml各约含1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液，照含量测定项下的色谱条件，精密量取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次是杂质ⅰ、非诺贝酸、杂质c和非诺贝特，任一相邻峰的分离度应不小于2.0；精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的15％～20％；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍。供试品溶液的色谱图中，如有与杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特峰保留时间一致的色谱峰，按校正后的峰面积计算(分别乘以校正因子0.59、0.65和0.8)，分别不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)；其他任一单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)。11、连续生产的工艺验证批样品和中试样品有关物质测定取7批样品，依法测定，结果见下表：表14样品有关物质检查结果结果显示，七批样品的有关物质测定均符合规定。12、与参比制剂非诺贝特缓释胶囊杂质对比样品检测中显示，自制7批原料药未检出三个特定杂质，只检出一个未知杂质，含量均在0.02％～0.03％范围内。而与本品同时申报的非诺贝特胆碱缓释胶囊研究中，对2批参比制剂有关物质进行了检测，结果显示2批参比制剂在非杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特处均检出2个未知杂质，含量均在0.04％～0.05％范围内，说明自制原料药非诺贝特胆碱比参比制剂杂质少并且小，说明用本工艺生产的样品质量较好。三、残留溶剂(异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、氯苯和苯甲醚)检测方法的优选及验证1、溶剂种类和限度本品合成过程中涉及到的溶剂有异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、丙酮和乙醇。其中三类溶剂丙酮和乙醇为中间步骤所用溶剂，异丙醇为成品精制所用溶剂，根据《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》，丙酮和乙醇可以不做研究，而异丙醇需要做研究。苯甲醚为起始物料，我们对其进行研究；氯苯可能带入苯，我们对苯也进行了研究。其中苯是第一类溶剂，二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯是第二类溶剂，异丙醇是第三类溶剂，为了准确测定样品中有机溶剂的残留，我们参照《中国药典》2015年版二部附录ⅷp残留溶剂测定法第二法毛细管柱顶空进样系统程序升温法，对六个溶剂进行了研究。本试验属于限度检查，应根据残留溶剂的限度规定确定对照品溶液的浓度。拟定供试品溶液配制为100mg/ml的浓度，而对照品溶液配制为每1ml中分别含异丙醇0.5mg、苯甲醚0.5mg、苯0.2μg、二氯甲烷60ug、三氯甲烷6ug和氯苯36μg的混合溶液。2、方法筛选我们分别以二甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺-水(5:1)、甲醇、10％甲醇溶液为溶剂进行筛选，同时筛选不同的色谱条件。经过筛选，优选的溶剂及色谱条件筛选结果溶剂：10％甲醇溶液载气流速：氮气，柱流速2.0ml/min，分流比20：1。柱温：40℃保持8分钟，以30℃/min的速率升温至200℃，保持5分钟。进样口温度：200℃检测器温度：250℃。顶空平衡温度70℃，平衡30分钟；3、专属性试验峰定位样品溶液的配制：称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，分别用甲醇溶解，摇匀，作为各自定位溶液。对照品溶液的配制：称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置于同一量瓶中，用10％甲醇溶解，摇匀，作为对照品溶液。样品溶液(xs20140501批)：取本品1g，精密称定，置10ml量瓶中，加10％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。以10％甲醇为空白溶剂。取上述各溶剂定位溶液、供试品溶液、对照品溶液、空白溶剂各5ml，分别置于顶空瓶中，依法进样，记录色谱图。表15专属性试验结果名称保留时间(分钟)分离度异丙醇4.062——二氯甲烷4.5155.338三氯甲烷8.29734.798苯9.2858.903氯苯12.88750.506苯甲醚13.71815.775由试验图谱可看出空白溶剂和非诺贝特胆碱对各待测溶剂的测定均无干扰，测定结果满足测定要求，说明该升温程序有利于各溶剂峰的检出。4、系统适用性试验称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解并用10％甲醇溶液稀释制成每1ml约含三氯甲烷6μg、氯苯36μg、二氯甲烷60μg、苯0.2μg、苯甲醚0.5mg和异丙醇0.5mg的混合溶液，摇匀，作为对照品对照品溶液，精密量取5ml置于顶空瓶中，连续进样6次，记录色谱图。试验结果表明，各溶剂峰的理论塔板数均大于5000，峰间分离度良好，均不小于1.5，连续进样6次，各测定峰保留时间rsd均小于2.0％，各测定峰峰面积rsd均小于10.0％，仪器精密度良好。5、溶液稳定性试验称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解并用10％甲醇溶液稀释制成每1ml约含三氯甲烷6μg、氯苯36μg、二氯甲烷60μg、苯0.2μg、苯甲醚0.5mg和异丙醇0.5mg的混合溶液，摇匀，作为对照品贮备液；称取非诺贝特胆碱(xs20140501批)约5g，精密称定，置50ml容量瓶中，用上述对照品贮备液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，放置17小时，分别于0h、1h、2h、4h、6h、17h时量取5ml置顶空瓶中，进样，记录色谱图。由试验结果可知，6种溶剂的混合溶液在室温条件下放置17小时，各溶剂峰面积的相对标准偏差均不大于10％，说明溶液较稳定。6、耐用性试验称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解并用10％甲醇溶液稀释制成每1ml约含三氯甲烷6μg、氯苯36μg、二氯甲烷60μg、苯0.2μg、苯甲醚0.5mg和异丙醇0.5mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。供试品溶液：精密称取非诺贝特胆碱(xs20140501)约5g，精密称定，置50ml量瓶中，加10％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。分别取对照品溶液和供试品溶液，在不同测定方法中检测样品结果，并比较结果变化情况，从试验结果可以看出，非诺贝特胆碱(xs20140501批)检测出异丙醇残留。在实验条件变动情况下，试验结果相差不大，说明柱温在35℃～45℃范围内变动、进样口温度在190℃～210℃范围内变动、检测器温度在240℃～260℃范围内变动、柱流速在1.8ml/min～2.2ml/min范围内变动，不影响非诺贝特胆碱中这6种溶剂的测定。7、检测限与定量限称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置于同一量瓶中，加甲醇振摇使溶解，用10％的甲醇溶液依次稀释至各成分峰高约为基线噪音的3、10倍，此时的进样量即为6种溶剂的检测限和定量限，结果表明，用该色谱条件检测非诺贝胆碱中的6种溶剂，灵敏度高。按定量限浓度配制各待测溶剂的样品溶液，各连续进样6针，结果表明，各待测溶剂保留时间的相对标准偏差不大于2.0％，峰面积的相对标准偏差不大于10.0％。.8、线性关系称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，精密称定，置同一容量瓶中用甲醇溶解，摇匀，作为线性试验贮备液；精密量取贮备液适量用10％的甲醇溶液稀释，得线性试验系列溶液。进样，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，计算相关系数r。六个待测溶剂中，异丙醇浓度在4.571μg/ml～761.904μg/ml、二氯甲烷浓度在0.518μg/ml～86.288μg/ml、三氯甲烷浓度在0.503μg/ml～12.576μg/ml、苯浓度在0.0163μg/ml～0.4075μg/ml、氯苯浓度在0.0564μg/ml～70.528μg/ml、苯甲醚浓度在0.204μg/ml～850.240μg/ml范围内，线性关系均良好。9、加样回收试验称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解并用10％的甲醇溶液稀释制成每1ml约含三氯甲烷0.15mg、氯苯0.9mg、二氯甲烷1.5mg、苯5μg、苯甲醚12.5mg和异丙醇12.5mg的混合溶液，摇匀，作为对照品贮备液；精密吸取对照品贮备液2ml置于50ml量瓶中，加10％的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液1，取5ml置于顶空瓶中，依法进样，记录色谱图。另依法配制一份对照品溶液，作为对照品溶液2，取5ml置于顶空瓶中，依法进样，记录色谱图。称取非诺贝特胆碱(xs20140501批)0.5g，四份，精密称定，分别置于顶空瓶中，精密加入10％甲醇溶液5ml振摇溶解，密封，依法进样，记录色谱图，计算该样品异丙醇残留量为：0.30％，其他溶剂未检出。分别取对照品贮备液1.6ml、2ml、2.4ml，分别置三个50ml量瓶中，用10％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为相对标准浓度分别为80％、100％、120％的标准测试液；称取非诺贝特胆碱约1g，共9份，精密称定，分置10ml量瓶中，分别加相对标准浓度分别为80％、100％、120％的标准测试液各三份，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别量取5ml置于顶空瓶中，作为浓度为80％、100％、120％的供试品溶液，依法进样，记录色谱图，计算回收率，结果可知，用本法测定非诺贝特胆碱中6种溶剂的回收率，准确度高，回收良好。10、重复性试验称取异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、氯苯、苯甲醚和苯各适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解并用10％的甲醇溶液稀释制成每1ml约含三氯甲烷60μg、氯苯360μg、二氯甲烷600μg、苯2μg、苯甲醚5mg和异丙醇5mg的混合溶液，摇匀，作为对照品贮备液，称取非诺贝特胆碱(xs20140501批)约1g，6份，精密称定，分别置10ml量瓶中，精密加1ml对照品贮备液，用10％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。取5ml置顶空瓶中，进样，记录色谱图。由上述试验结果可知，重复测定6份不同的样品，重复性良好。11、确定方法及样品检验通过方法学试验，证明用拟定的方法测定非诺贝特胆碱的残留溶剂专属性强，准确度高，耐用性好，则确定该方法：取本品约0.5g，精密称定，置顶空瓶中，精密加10％甲醇溶液5ml振摇均匀，密封，作为供试品溶液；另精密称异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、氯苯和苯甲醚，加10％的甲醇溶液解并用稀释制成每1ml中分别含异丙醇0.5mg、苯甲醚0.5mg、二氯甲烷0.06mg、三氯甲烷6ug、氯苯36μg和苯0.2μg的混合溶液，精密量取5ml，置于顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。照残留溶剂测定法(中国药典2010年版二部附录ⅷp第二法)试验，以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相似)为固定液的毛细管色谱柱；初始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟30℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为70℃，平衡时间为30分钟。取对照品溶液顶空进样，各成分峰之间的分离度均应符合规定。再取供试品溶液和对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，均应符合规定。用该方法对小试三批样品及四批中试样品进行检验，结果见下表：表16残留溶剂测定结果批号氯苯二氯甲烷三氯甲烷异丙醇苯苯甲醚xs20140501未检出未检出未检出0.30％未检出未检出xs20140502未检出未检出未检出0.18％未检出未检出xs20140503未检出未检出未检出0.17％未检出未检出zs20140601未检出未检出未检出0.10％未检出未检出zs20140602未检出未检出未检出0.11％未检出未检出zs20140701未检出未检出未检出0.10％未检出未检出zs20140702未检出未检出未检出0.10％未检出未检出由试验结果可以看出，7批样品按照确定的残留溶剂检测方法进行检测，除异丙醇检出外，其余苯、苯甲醚、二氯甲烷、三氯甲烷和氯苯均未检出。方法学研究及样品检测结果均表明，该有机溶剂残留检测方法能有效检测出样品中的异丙醇、苯、苯甲醚、二氯甲烷、三氯甲烷和氯苯残留。附图说明图1、非诺贝特胆碱含量测定方法学图谱图2、非诺贝特胆碱有关物质检查方法学图谱图3、非诺贝特胆碱残留溶剂检测方法学图谱具体实施方式通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。实施例1、非诺贝特胆碱含量的测定：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液-乙腈(32：68)为流动相；检测波长为300nm，流速：1.0ml/min，理论板数按非诺贝酸峰计算不低于2500，拖尾因子不大于2.0，流动相调节溶液ph值至3.0，测定法取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-水(80：20)振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加甲醇-水(80：20)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取非诺贝酸对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，并将结果乘以1.3236，即得。实施例2、非诺贝特胆碱有关物质的检查取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取杂质ⅰ(4'-氯-4-羟基二苯甲酮)对照品、非诺贝酸对照品、杂质c((3rs)-3-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]丁基-2-酮)对照品、非诺贝特对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml各约含1μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液，照含量测定项下的色谱条件进样20μl，记录色谱图，出峰顺序依次是杂质ⅰ、非诺贝酸、杂质c和非诺贝特，任一相邻峰的分离度应不小于2.0；另取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的15％～20％；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍。供试品溶液的色谱图中，如有与杂质ⅰ、杂质c和非诺贝特峰保留时间一致的色谱峰，按校正后的峰面积计算(分别乘以校正因子0.59、0.65和0.8)，分别不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)；其他任一单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)。实施例3、非诺贝特胆碱残留溶剂检查取本品约0.5g，精密称定，置顶空瓶中，精密加10％的甲醇溶液5ml振摇溶解，密封，作为供试品溶液；另取三氯甲烷、氯苯、二氯甲烷和异丙醇适量，精密称定，加10％的甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中分别含三氯甲烷6μg、氯苯36μg、二氯甲烷60μg和异丙醇0.5mg的混合溶液，摇匀，精密量取5ml，置于顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。照残留溶剂测定法(中国药典2010年版二部附录ⅷp第二法)试验，以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相似)为固定液的毛细管色谱柱；初始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟30℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为70℃，平衡时间为30分钟。取对照品溶液顶空进样，各成分峰之间的分离度均应符合规定。再取供试品溶液和对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，均应符合规定。当前第1页12