一种快速定量测定红曲米中桔霉素含量的方法与流程

本发明属于桔霉素含量检测技术领域，具体涉及红曲米中桔霉素含量的定量测定方法。

背景技术：

食品的色彩是食品感观品质的一个重要因素，目前使用的食用色素有天然色素和合成色素两大类。合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、稳定性好且生产成本低廉等优点，但已被证实具有不同程度的毒副作用，其安全性受到了质疑。随着人们对健康饮食的关注，合成色素在食品工业中逐步被天然色素所取代。从动植物中提取天然色素生产成本较高，而利用微生物发酵生产天然色素可大规模长年化生产，原料转化率高，成本低，因此，采用微生物发酵法生产色素成为天然色素生产主流。其中，红曲色素是世界上目前唯一允许在食品中使用的天然真菌色素，它是红曲霉(monascussp.)在籼米、粳米、糯米等稻米上生长代谢过程中产生的多种天然色素的混合物。与合成色素相比，红曲色素具有性质稳定、耐热性强(100℃色调保持不变)和对蛋白质着色力好等特点，通过急性、亚急性、慢性毒性试验和致畸性试验，已经证明红曲色素没有毒性和致畸作用，在我国也已有一千多年的食用历史，安全性极高。此外，药理研究表明，它还具有抑菌、降血脂、抗老年痴呆和抗癌等生理功效，因而红曲色素符合食品着色剂“天然、营养、多功能”的发展方向，具有很好的应用前景，被广泛应用于制醋、制酒、酱油、饮料、腐乳、香肠、肉制品等食品中，此外还可用于医药和化妆品等方面，风靡日本、东南亚等地区，美国与欧洲也一直从中国进口红曲，市场需求也稳步上升。目前，我国红曲色素的生产仍以传统的固态发酵法为主，主要产品是红曲米。

1995年法国blanc博士等发现红曲霉在发酵过程中会产生具有肾毒性、致畸性以及致癌性的桔霉素，从而引起人们对红曲色素食用安全性的极大关注。桔霉素是曲霉属、青霉属和红曲霉代谢所产生的的一种真菌毒素，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。进一步研究发现，桔霉素毒性虽然不如黄曲霉毒素b2,但在国外,仍将其作为食品污染的严格控制指标。最新研究结果表明,桔霉素还对基因有毒性效应。目前，红曲发酵生产过程中常伴随产生桔霉素，已严重影响到红曲产品安全，各国家或地区都相继制定了关于红曲产品中桔霉素的限量标准。

目前桔霉素的检测方法除了常用的高效液相色谱法外，还有酶联免疫测定法、抑菌圈法、薄层层析法等。酶联免疫测定特异性好、前处理简单，但是其结果的重复性和可靠性易受保存条件和检测环境的影响，经常给出太高的分析结果；抑菌圈法检测红曲中桔霉素的含量操作快速简便，但红曲中存在多种抗菌物质，影响因素较多，因此不够准确；薄层色谱在检测桔霉素时产生的荧光较弱，在硅胶板上层析出来的样品可能出现拖尾现象而致结果不稳定，所以该法目前仅用于桔霉素的定性测定；hplc法是目前检测桔霉素的一种有效手段，具有更高的灵敏度，但是其设备昂贵、操作复杂，检测时间较长，因而使用受到限制。因此，生产实践中需要建立一种快速、简便、灵敏的检测红曲米桔霉素含量的定量方法。

从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。桔霉素分子具有共轭的平面结构，使其具有天然的荧光能力，利用桔霉素的这种特性可以用于检测食品中的桔霉素。20世纪70年代，有研究者提出了利用荧光分光光度法测定谷物中的桔霉素。

红曲米产品的显著特点是色素种类多、色素含量高、桔霉素微量，虽然桔霉素可以使用荧光分光光度法精确定量，但在红曲中并不适用，因为常用的荧光分光光度法是直接测定红曲米提取液，可是由于荧光淬灭的发生，导致测定的准确性很差，造成红曲米提取液发生荧光淬灭的原因除了因为红曲中的桔霉素自淬灭外，还因为红曲含有荧光淬灭剂。

技术实现要素：

本发明为了解决红曲米中含有荧光猝灭剂，而导致无法使用荧光光度法测定其桔霉素含量的问题，提出了一种全新的快速定量测定红曲米中桔霉素含量的方法，该方法测定桔霉素的含量准确，测定方法简单，解决了荧光猝灭的问题，具有良好的商业前景。所述测定红曲米中桔霉素含量的方法包括如下步骤：

①用ph＝1～2的甲醇配制至少4个已知浓度的桔霉素标准溶液，并在激发波长λex＝320～350nm，发射波长λem＝470～500nm的条件下测定每个桔霉素标准溶液的荧光强度，根据桔霉素标准溶液的浓度和其对应的荧光强度建立桔霉素的标准曲线；

②将红曲米粉碎至10～100目，得到红曲米粉；

③称取m重量的红曲米粉，加入65～80％的甲醇溶液，超声萃取红曲米粉；其中所述超声萃取具体为：在温度20～35℃，超声频率为30～50khz，超声功率为140～200w的条件下超声提取5～30min；超声提取完成后离心处理，取上清液，为提取液；

④将提取液加入65～80％的甲醇溶液，搅拌均匀，在50～65℃的条件下减压干燥完全，得到红曲提取物；

⑤准确称取n重量的红曲提取物，并将红曲提取物用已知v体积的ph为1～2的甲醇复溶，至完全溶解，得到红曲提取液；

⑥将红曲提取液继续用ph为1～2的甲醇稀释y倍，得到荧光检测液，其中，200≤y≤800；

⑦将荧光检测液置于在激发波长λex＝320～350nm，发射波长λem＝470～500nm的条件下测定其荧光强度，得到待测荧光强度；

⑧将待测荧光强度带入桔霉素标准曲线方程，得到荧光检测液中桔霉素的浓度，

待测红曲米中桔霉素的含量＝(荧光检测液中桔霉素的浓度*v*y/m)*100％。

进一步，所述桔霉素标准溶液的浓度范围为0.01～0.15μg/ml。

进一步，步骤③中，所述红曲米粉与65～80％的甲醇溶液的质量体积比为：1:3～1:5。

进一步，所述步骤③中，超声萃取红曲米粉的次数为1～5次，多次萃取后，将各次提取液合并，得到提取液。

进一步，所述步骤③中，离心处理为在6000～10000r/min的条件下离心5～20min。

有益效果

本发明利用桔霉素具有强荧光的特性，采用荧光分光光度法来定量测定红曲米中的桔霉素。本发明前处理方法简单、提取溶剂毒性低，方法的精密度、准确性均能够满足分析方法的要求，检出限为10μg/kg，可以满足各国现行的对红曲米桔霉素定量测定的要求，并且本发明方法与目前广泛采用的hplc法相比较，实验结果无显著性差异。相对于操作较为繁琐、并且设备昂贵的hplc法，本发明为红曲米中桔霉素的检测提供了一种可靠、灵敏、操作简便、经济可行的方法。

虽然有文献报道了桔霉素具有荧光特性，并可以利用荧光特性对谷物中的桔霉素含量经行测定，但实验发现，在优化好的测定条件下测定红曲米提取液的荧光强度时会出现荧光淬灭现象，这可能是因为红曲米中存在一定量的荧光淬灭剂。本研究采用了一系列的预处理和提取方法后，并将红曲米提取液进行高倍稀释，成功避免了红曲中的荧光淬灭剂对桔霉素测定的干扰。本研究先将样品桔霉素含量用hplc法进行测定，将2个红曲米样品所制备的提取液稀释不同倍数，向其中加入终浓度为0.1μg/ml的桔霉素，在激发波长为330nm、发射波长为485nm的条件下测定荧光强度，经检测，桔霉素含量为49μg/g的1#红曲米提取液随着稀释倍数的增加荧光强度随之增加，到稀释倍数为500时不再增加，表明红曲米提取液中存在某种淬灭剂，当其浓度高于某一阈值时能使桔霉素发生荧光淬灭，导致荧光强度降低，当稀释到500倍时，淬灭剂与桔霉素发生碰撞的机率减小到可以忽略不计，因而不影响红曲米中桔霉素的测定。值得注意的是，红曲米提取液的最低稀释倍数与桔霉素含量之间存在正相关，例如1#红曲米提取液桔霉素含量为2#红曲米提取液的2.46倍，1#红曲米提取液荧光强度稳定时对应的最低稀释倍数(500)也恰恰是2#红曲米提取液最低稀释倍数(200)的2.5倍。

表1为添加终浓度为0.1μg/ml桔霉素的不同稀释倍数红曲米提取液的荧光强度，表上的1#和2#红曲米样品的提取原液均测不出荧光值，提取原液直到稀释到4倍时才可以测定得出荧光值，荧光值的均值如上表中所示，这两个荧光值明显小于其他稀释倍数的现象表明未经合理稀释的红曲米提取液发生了荧光淬灭。说明：表1中fi数据上的不同字母代表具有显著性差异p﹤0.05。

为探究红曲米提取液发生淬灭的原因进行了进一步的深入研究。研究发现，当桔霉素标准液在0.1～0.8μg/ml浓度范围内，桔霉素浓度与荧光强度呈良好的线性相关(r²＝0.996)。当桔霉素标准液浓度高于0.8μg/ml，其相应的荧光强度高于915时会发生荧光淬灭。然而，对于桔霉素含量已知的红曲米提取液(用hplc定量测定)，根据其桔霉素含量，稀释红曲米提取液使其桔霉素含量在0.1～0.8μg/ml的浓度范围内，但是，无论怎样尝试，其稀释液的荧光强度值都不会高于300。实验发现，在一个稀释了500倍的红曲米提取液中加入终浓度为0.2、0.4、0.6μg/ml的桔霉素标准液，结果显示加标的这三个红曲米提取液的荧光值与其桔霉素浓度呈线性相关(r²＝0.994)，其中加标0.6μg/ml的桔霉素标准液的这个红曲米提取液的荧光强度为583，这表明红曲米中含有的荧光淬灭剂是导致红曲米提取液发生荧光淬灭的主要原因，而桔霉素的自淬灭是次要原因。

为此，本发明探索了一种新的适用于红曲的预处理方法，完全避免了红曲中的荧光猝灭剂的干扰，建立了一种全新的红曲米中测定桔霉素的方法。

首先，本发明建立了一条低浓度桔霉素标准曲线，如图1所示，在0～0.15μg/ml范围内桔霉素浓度与荧光强度之间呈现良好的线性关系，相关系数为0.999。因此，测定红曲米样品时需要将样品高倍稀释，在激发波长λex＝330nm和发射波长λem＝485nm条件下测定各稀释液的荧光强度，找出荧光强度趋于稳定的最低稀释倍数，根据标准曲线得出桔霉素浓度，再乘以相应的最低稀释倍数，从而得出实际的桔霉素浓度。

本发明利用桔霉素具有强荧光的特性，采用荧光分光光度法来定量测定红曲米中的桔霉素。本发明前处理方法简单、提取溶剂毒性低，方法的精密度、准确性均能够满足分析方法的要求。相对于操作较为繁琐、并且设备昂贵的hplc法，本发明为红曲米中桔霉素的检测提供了一种可靠、灵敏、操作简便、经济可行的方法。

表1：添加终浓度为0.1μg/ml桔霉素的不同稀释倍数红曲米提取液的荧光强度数据表。

附图说明：

图1：荧光分光光度法测定桔霉素的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例子进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。

桔霉素标准品(纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司，色谱级试剂购自韩国德山化工，红曲米样品购自市场。

1、hplc法测定红曲米中桔霉素含量。

称取2.5g红曲米粉末，加入10ml70％甲醇，在30℃，152w的超声功率下超声处理10min，重复提取1次，再用70％甲醇定容到25ml，在60℃下将溶剂蒸干后用色谱级甲醇进行复溶测定。

色谱条件为：反相c18色谱柱(techway,jade-pakods-aq-c18,5μm,250×4.6mm)；进样量20μl，流速1ml/min；荧光检测：ex＝350nm、em＝500nm；流动相a为乙腈，流动相b为0.1％磷酸，如下表进行梯度洗脱。

流动相及洗脱条件表

2、本发明提供的桔霉素含量的测定方法的精密度、回收率的检验方法

精密度的检验：按照本试验方法设定的条件，在一天之内测定0.1μg/ml的桔霉素标准液、2个红曲米样品，每个样品平行测定6次，计算rsd，得到日内精密度；连续3天测定0.1μg/ml的桔霉素标准液、2个红曲米样品，每个样品平行测定6次，计算rsd，得到日间精密度。

回收率的检验：准确称取2g红曲米样品5份，加入桔霉素标准液至终浓度分别为10、30、50、100、150mg/kg的桔霉素标准样品，对样品采用相同的方法预处理并提取，最后用ph为1.5的甲醇溶液定容至20ml，测定样品中桔霉素含量，计算回收率。

实施例1

本实施例提供了一种快速定量测定红曲米中桔霉素含量的方法，具体方法如下：

1、桔霉素标准溶液的配制及建立桔霉素标准曲线

准确称取1mg桔霉素标准品，用10mlph1.5的甲醇将其配制成100μg/ml的桔霉素标准储备液，并采用ph1.5的甲醇将标准储备液稀释成10μg/ml的工作液。

将桔霉素工作液10μg/ml分别稀释成0.01、0.03、0.05、0.08、0.10、0.12、0.15

μg/ml的桔霉素标准溶液，将桔霉素标准溶液置于激发波长λex＝330nm，发射波长λem＝485nm的荧光分光光度计中，测定其在此条件下的荧光强度。得到在0.01～0.15μg/ml范围内桔霉素浓度与荧光强度之间的线性方程，由线性方程可以看出，桔霉素浓度和荧光强度呈现良好的线性关系。本实施例的线性方程见表1，y＝1865.4x+2.0566。

2、将红曲米粉碎至10～100目，得到红曲米粉。

3、超声处理萃取红曲米粉。

称取2.5g红曲米粉，然后按照样品：70％甲醇溶液＝1:4(m/v)进行萃取，室温下涡旋振荡充分混匀，并超声提取处理，其中所述超声提取处理具体为：在温度30℃，超声频率为40khz，超声功率为140w的条件下超声提取30min。超声提取完成后在8000r/min的条件下离心10min，取上清液，得到一次提取液，滤渣为一次滤渣。再用同样的方法将一次滤渣再萃取一次，得到二次提取液。

4、将两次提取液合并得到提取液，用70％甲醇溶液将体积补足到25ml，在60℃的条件下减压干燥完全。

5、用25mlph为1.5的甲醇复溶并将红曲提取液用ph为1.5的甲醇稀释200倍，得到荧光检测液。

6、将荧光检测液置于激发波长λex＝330nm，发射波长λem＝485nm的荧光分光光度计测定其荧光度，得到待测荧光强度。

若超出分光光度计的量程，则根据荧光分光光度计量程的不同对样品溶液再稀释x倍，荧光检测液的实际荧光度＝测得荧光度*x。

7、将待测荧光强度带入桔霉素标准曲线方程，y＝1865.4x+2.0566，得到红曲米中桔霉素的浓度。

实施例1的方法精密度和回收率检验

将标准桔霉素(桔霉素含量为0.1μg/ml)、2份红曲米样品(桔霉素含量分别为75.99mg/kg和48.29mg/kg)按照试验方法测定桔霉素含量，结果见表5，日内精密度rsd小于2.99％，日间精密度rsd小于3.84％，可见本方法的精密度良好。

荧光分光光度法测定桔霉素的精密度表

回收率是评价一种方法准确度的重要指标，在样品中加入不同水平已知量的标准物质(将标准物质的量作为真值)称为加标样品，同时测定样品和加标样品，加标样品扣除样品值后与真值的百分比即为回收率。对红曲米样品进行了5个不同浓度水平(10、30、50、100、150mg/kg)的加标回收率实验，结果如表6所示，样品中添加不同浓度桔霉素的回收率为91.63％-96.60％，该回收率高于国内外所报道的液相法测定桔霉素的回收率。

红曲米样品加标回收率表

实施例2

本实施例提供了一种快速定量测定红曲米中桔霉素含量的方法，具体方法如下：

1、桔霉素标准溶液的配制及建立桔霉素标准曲线

准确称取1mg桔霉素标准品，用10mlph1.5的甲醇将其配制成100μg/ml的桔霉素标准储备液，并采用ph1.5的甲醇将标准储备液稀释成10μg/ml的工作液。

将桔霉素工作液10μg/ml分别稀释成0.01、0.03、0.05、0.08、0.10、0.12、0.15

μg/ml的桔霉素标准溶液，将桔霉素标准溶液置于激发波长λex＝320nm，发射波长λem＝470nm的荧光分光光度计中，测定其在此条件下的荧光强度。得到在0.01～0.15μg/ml范围内桔霉素浓度与荧光强度之间的线性方程，由线性方程可以看出，桔霉素浓度和荧光强度呈现良好的线性关系。

2、将红曲米粉碎至10～100目，得到红曲米粉。

3、超声处理萃取红曲米粉。

称取2.5g红曲米粉，然后按照样品：80％甲醇溶液＝1:3(m/v)进行萃取，室温下涡旋振荡充分混匀，并超声提取处理，其中所述超声提取处理具体为：在温度20℃，超声频率为30khz，超声功率为200w的条件下超声提取10min。超声提取完成后在6000r/min的条件下离心20min，取上清液，得到一次提取液，滤渣为一次滤渣。再用同样的方法将一次滤渣再萃取一次，得到二次提取液，同理，可以得到三次提取液、四次提取液和五次提取液。

4、将一次提取液～五次提取液合并得到提取液，用80％甲醇溶液将体积补足到25ml，在50℃的条件下减压干燥完全，得到红曲提取物。

5、用25mlph为2的甲醇复溶，得到红曲提取液，并用ph为2的甲醇将将红曲提取液稀释200倍，得到荧光检测液。

6、将荧光检测液置于激发波长λex＝320nm，发射波长λem＝470nm的荧光分光光度计测定其荧光度，得到待测荧光强度。

若超出分光光度计的量程，则根据荧光分光光度计量程的不同对样品溶液再稀释x倍，荧光检测液的实际荧光度＝测得荧光度*x。

7、将待测荧光强度带入步骤1得到桔霉素标准曲线方程，得到红曲米中桔霉素的浓度。

实施例3

本实施例提供了一种快速定量测定红曲米中桔霉素含量的方法，具体方法如下：

1、桔霉素标准溶液的配制及建立桔霉素标准曲线

准确称取1mg桔霉素标准品，用10mlph1.5的甲醇将其配制成100μg/ml的桔霉素标准储备液，并采用ph1.5的甲醇将标准储备液稀释成10μg/ml的工作液。

将桔霉素工作液10μg/ml分别稀释成0.01、0.03、0.05、0.08、0.10、0.12、0.15

μg/ml的桔霉素标准溶液，将桔霉素标准溶液置于激发波长λex＝350nm，发射波长λem＝500nm的荧光分光光度计中，测定其在此条件下的荧光强度。得到在0.01～0.15μg/ml范围内桔霉素浓度与荧光强度之间的线性方程，由线性方程可以看出，桔霉素浓度和荧光强度呈现良好的线性关系。

2、将红曲米粉碎至10～100目，得到红曲米粉。

3、二次超声处理萃取红曲米粉。

称取2.5g红曲米粉，然后按照样品：65％甲醇溶液＝1:5(m/v)进行萃取，室温下涡旋振荡充分混匀，并超声提取处理，其中所述超声提取处理具体为：在温度35℃，超声频率为50khz，超声功率为180w的条件下超声提取5min。超声提取完成后在10000r/min的条件下离心5min，取上清液，得到一次提取液，滤渣为一次滤渣。再用同样的方法将一次滤渣再萃取一次，得到二次提取液，同理，可以得到三次提取液。

4、将一次提取液～三次提取液合并得到提取液，用65％甲醇溶液将体积补足到25ml，振荡均匀后在65℃的条件下减压干燥完全，得到红曲提取物。

5、用25mlph为1的甲醇复溶，得到红曲提取液，并用ph为1的甲醇将将红曲提取液稀释200倍，得到荧光检测液。

6、将荧光检测液置于激发波长λex＝350nm，发射波长λem＝500nm的荧光分光光度计测定其荧光度，得到待测荧光强度。

若超出分光光度计的量程，则根据荧光分光光度计量程的不同对样品溶液再稀释x倍，荧光检测液的实际荧光度＝测得荧光度*x。

7、将待测荧光强度带入步骤1得到桔霉素标准曲线方程，得到红曲米中桔霉素的浓度。