一种测定豆芽中6-苄基腺嘌呤的方法与流程

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种测定豆芽中6-苄基腺嘌呤的方法。

背景技术：

豆芽，又名如意菜，近年来深受广大消费者喜爱，部分不法商家为缩短生产周期、增加产量、改善豆芽外观以便于销售，在豆芽培育过程中非法使用“ab粉”、“无根豆芽素”等，6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-ba)则是其中主要成分，属植物生长调节剂类激素残留，弱毒蓄积性，达到一定剂量会显示某些胚胎毒作用。6-苄基腺嘌呤在食品中使用与残留受到越来越广泛的关注，许多国家和国际组织均制定了6-苄基腺嘌呤残留的限量标准。美国允许6-苄基腺嘌呤作为植物生长调节剂用于农业生产，无残留限定，但使用范围都不包括豆芽；欧盟允许包括绿豆芽在内的多种农产品使用6-苄基腺嘌呤使用，残留限量为0.01mg/kg；日本则将6-苄基腺嘌呤列入《肯定列表》目录，并分别制定了残留限量。2015年4月13日，我国国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会发布《关于豆芽生产过程中禁止使用6-苄基腺嘌呤等物质的公告(2015年第11号)》，禁止豆芽中添加或使用6-苄基腺嘌呤。因此，豆芽中6-苄基腺嘌呤残留检测应引起足够的重视。

在豆芽样品检测中，因实际样品基质组分较为复杂，干扰物质多且目标物含量较低，通常需要采用适当的前处理技术才能进行分析测定。当前关于豆芽中6-苄基腺嘌呤的检测方法中，前处理技术主要有固相萃取、分散固相微萃取、液液萃取等，然而这些传统的技术存在不少缺点：实验操作冗繁、耗时，萃取效率低，过程中消耗大量有机试剂，易对环境产生污染；同时，目前国内外用于豆芽中6-苄基腺嘌呤的检测方法主要有离子色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、高效液相色谱-飞行时间质谱法和高效液相色谱-串联质谱法等，有引入干扰而出现假阳性结果。

目前未见将超声辅助-分散液液微萃取前处理技术联用超高效液相色谱-串联质谱仪应用于豆芽中使用6-苄基腺嘌呤检测的研究。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种测定豆芽中6-苄基腺嘌呤的方法。

本发明测定豆芽中6-苄基腺嘌呤的方法，它是采用超声辅助-分散液液微萃取-超高效液相色谱-串联质谱的测定方法，包括如下步骤：

(1)制备基质提取液：取待测豆芽样品粉碎，加甲醇提取，再加无水硫酸钠和氯化钠提取，离心，取上清液过滤，得基质提取液；

(2)制备供试品溶液：取基质提取液，依次加入水和氯化钠溶解，再注入萃取剂混匀，萃取，离心，取底层沉积相作为供试品溶液；

(3)制备标准工作溶液：称取6-苄基腺嘌呤标准品，加甲醇溶解，稀释，用步骤(1)基质提取液定容，作为标准工作溶液；

(4)分别将标准工作溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析：

色谱条件如下：

色谱柱：c18色谱柱；

流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.1％甲酸水溶液；

梯度洗脱条件：

0～1min：10％甲醇，1～10min：90％甲醇，0～11min：10％甲醇，11～13min：10％甲醇；

质谱条件：

离子化模式，电喷雾离子源；

检测方式：正离子扫描；

扫描模式：选择反应监控；

(5)定性定量分析。

进一步地，步骤(1)所述样品、甲醇、无水硫酸钠和氯化钠的质量体积比为2g：10ml：5g：3g。

进一步地，步骤(1)所述提取为涡旋提取，涡旋提取速度为11000rpm，加甲醇涡旋提取的时间为3min，加无水硫酸钠和氯化钠涡旋提取的时间是1min。

进一步地，步骤(1)所述离心的转速为4500r/min，时间5min；和/或，所述过滤为过0.45μm滤膜。

进一步地，步骤(2)所述基质提取液、水、氯化钠和萃取剂的质量体积比为：1ml：5ml：1.5g：100μl；和/或，所述萃取剂为四氯乙烷；和/或，所述萃取为超声萃取，时间为10min；和/或，所述离心的转速为12000r/min，时间5min。

进一步地，步骤(3)所述标准工作液的浓度为0.2ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml和/或100ng/ml；所述定容时基质提取液的加入量为定容体积的1/2。

进一步地，步骤(4)所述c18色谱柱为watersatlantist3色谱柱，规格为150mm×2.1mm×3μm；和/或，所述色谱条件中，进样量：10μl，柱温为40℃，流速为0.5ml/min。

进一步地，步骤(4)所述质谱条件中，喷雾电压:4500v，金属毛细管温度：350℃，鞘气压力：30psi，辅助气压力：5psi，q1半峰宽:0.7da，q3半峰宽：0.7da。

更进一步地，所述质谱条件中，特征定量碎片离子n1碰撞能量：21ev，特征定性碎片离子n2碰撞能量：16ev。

进一步地，步骤(5)所述定性定量分析的方法为：通过特征定量母离子m和特征定性碎片离子n2进行定性；通过特征定量碎片离子n1峰面积外标法进行定量。

更进一步地，所述特征定量母离子m荷质比为225.3，特征定量碎片离子n1和特征定性碎片离子n2荷质比分别为91.0和148.0。

本发明检测6-苄基腺嘌呤的方法稳定性高，检测限低，萃取效率高，富集倍数大，有机溶剂消耗量小，易于操作，适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤的快速定性和定量分析，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1超高效液相色谱-串联质谱法检测6-苄基腺嘌呤的标准离子流(tic)色谱图；

具体实施方式

实施例1本发明6-苄基腺嘌呤定性检测

(1)制备基质提取液：准确称取经组织捣碎机充分粉碎的豆芽样品2.00g(精确至0.01g)至50ml具塞离心管中，加入10ml甲醇匀浆(转速为11000rpm)3min，然后加入5g无水硫酸钠和3g氯化钠，涡旋1min后以4500r/min离心5min，上清液过0.45μm滤膜后转移至10ml容量瓶，用甲醇定容，得基质提取液；

(2)制备供试品溶液：取1.00ml基质提取液至10ml具塞离心管中，依次加入5ml水、1.5gnacl，涡旋溶解，然后用1ml的玻璃注射器迅速将100μl四氯乙烷注入至上述溶液中，涡旋混匀，形成乳浊液，超声辅助萃取10min后，以12000r/min离心5min，用微量进样器取30μl底层沉积相样液，加入到含内插管的样品瓶中，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定；

(3)制备标准工作溶液：准确称取6-苄基腺嘌呤标准品，用甲醇配制成10mg/ml的标准储备液，备用。检测时，准确量取6-苄基腺嘌呤标准储备液100μl，用甲醇配制成1μg/ml的标准工作液，再准确量取6-苄基腺嘌呤标准工作液0.1ml，用甲醇稀释至0.5ml，再用步骤(1)基质提取液定容至1ml，配制成浓度为100ng/ml的标准工作溶液，即得；

(4)分别将标准工作溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析：

超高效液相色谱条件，色谱柱：watersatlantist3(3μm×2.1mm×150mm)；流动相：甲醇，0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序(0～1min，10％甲醇；1～10min，90％甲醇；10～11min，10％甲醇；11～13min，10％甲醇)；流速：0.5ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；

串联质谱条件，离子化模式：电喷雾离子源(esi)，正离子扫描；喷雾电压:4500v；金属毛细管温度：350℃；鞘气压力：30psi；辅助气压力：5psi；扫描模式：选择反应监控(srm)；q1半峰宽:0.7da；q3半峰宽：0.7da；特征定量碎片离子n1碰撞能量：21ev，特征定性碎片离子n2碰撞能量：16ev；

(5)定性分析：通过6-苄基腺嘌呤的特征定量母离子(m/z)m(荷质比225.3)和定性碎片离子n2(荷质比148.0)进行定性。

实施例2本发明6-苄基腺嘌呤定量检测

(1)制备基质提取液：准确称取经组织捣碎机充分粉碎的豆芽样品2.00g(精确至0.01g)至50ml具塞离心管中，加入10ml甲醇匀浆(转速为11000rpm)3min，然后加入5g无水硫酸钠和3g氯化钠，涡旋1min后以4500r/min离心5min，上清液过0.45μm滤膜后转移至10ml容量瓶，用甲醇定容，得基质提取液；

(2)制备供试品溶液：取1.00ml基质提取液至10ml具塞离心管中，依次加入5ml水、1.5gnacl，涡旋溶解，然后用1ml的玻璃注射器迅速将100μl四氯乙烷注入至上述溶液中，涡旋混匀，形成乳浊液，超声辅助萃取10min后，以12000r/min离心5min，用微量进样器取30μl底层沉积相样液，加入到含内插管的样品瓶中，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定；

(3)制备标准工作溶液：准确称取6-苄基腺嘌呤标准品，用甲醇配制成10mg/ml的标准储备液，备用。检测时，准确量取6-苄基腺嘌呤标准储备液100μl，用甲醇配制成1μg/ml的标准工作液，再分别准确量取6-苄基腺嘌呤标准工作液0.0002、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1ml，用甲醇稀释至0.5ml，再用步骤(1)基质提取液定容至1ml，配制成浓度分别为0.2、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的标准系列工作溶液；

(4)分别将标准系列工作溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析：

超高效液相色谱条件，色谱柱：watersatlantist3(3μm×2.1mm×150mm)；流动相：甲醇，0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序(0～1min，10％甲醇；1～10min，90％甲醇；10～11min，10％甲醇；11～13min，10％甲醇)；流速：0.5ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；

串联质谱条件，离子化模式：电喷雾离子源(esi)，正离子扫描；喷雾电压:4500v；金属毛细管温度：350℃；鞘气压力：30psi；辅助气压力：5psi；扫描模式：选择反应监控(srm)；q1半峰宽:0.7da；q3半峰宽：0.7da；特征定量碎片离子n1碰撞能量：21ev，特征定性碎片离子n2碰撞能量：

16ev；

(5)定量分析：通过6-苄基腺嘌呤的特征定量碎片离子n1(荷质比91.0)峰面积外标法进行定量。

以下通过实验例的方式进一步说明本发明的有益效果：

实验例1本发明检测待检豆芽样品中的6-苄基腺嘌呤的研究

1、实验材料

(1)仪器：ekspertultralc100型超高效液相色谱仪、absciextriplequad5500质谱仪[配有电喷雾源(esi源)](美国absciex)；超声波清洗仪(南京皓海科学仪器仪表有限公司)；高速离心机(德国thermo)；均质器(德国ika)

(2)试剂：甲醇：色谱纯(美国honeywell)；乙腈：色谱纯(美国honeywell)；四氯乙烷：色谱纯(美国honeywell)；甲酸：色谱纯(上海晶纯实业有限公司)；其余试剂：分析纯(上海安普科技仪器有限公司)；实验用水：milli-q去离子水；6-苄基腺嘌呤标准品，(德国drehremstorfer，纯度≥99.0％)；

(3)样品：豆芽来自国内市场。

2、实验方法

(1)配制标准溶液和基质提取液

标准储备液：准确称取6-苄基腺嘌呤标准品适量，用甲醇配制成10mg/ml的标准储备液。标准工作液：准确量取6-苄基腺嘌呤标准储备液100μl，用甲醇配制成1μg/ml的标准工作液。标准工作系列溶液：准确量取6-苄基腺嘌呤标准工作液0.0002、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1ml，用甲醇稀释，配制成标准系列工作溶液。

基质提取液：称取经组织捣碎机充分粉碎的阴性豆芽样品2.00g至50ml具塞离心管中，加入10ml甲醇匀浆(转速为11000rpm)3min后加入5g无水硫酸钠和3g氯化钠，涡旋1min后以4500r/min离心5min，过0.45μm滤膜后备用。

(2)检测方法选用实施例1或2检测方法

(3)灵敏度验证准确移取6-苄基腺嘌呤标准工作液，用实施例1或2实验方法基质提取液定容，配制成浓度为0.2、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的标准工作曲线，按照实施例1或2检测方法步骤(4)，以定量离子的峰面积y为纵坐标，质量浓度x(ng/ml)绘制标准曲线，以3倍信噪比确定目标物的方法检出限、10倍信噪比确定目标物的方法定量限。

(4)回收率、富集因子和精密度验证取豆芽样品进行加标回收试验。称取空白样品2g，分别添加0.5、1.5、10μg/kg三个水平的6-苄基腺嘌呤标准溶液，按照实施例2检测方法测定，峰面积外标法计算6-苄基腺嘌呤的回收率和相对标准偏差。以6-苄基腺嘌呤在萃取剂中的富集后浓度与在样品溶液中的初始浓度之比确定富集因子ef。

(5)基质效应验证取阴性豆芽样品按实施例1或2实验方法制备阴性基质提取液，准确移取6-苄基腺嘌呤标准工作液，用甲醇稀释后，再用阴性基质提取液定容(体积比1:1)，配制成质量浓度为100ng/kg的目标物标准溶液，以甲醇为定容液配制另一同等质量浓度的标准溶液，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析，计算两者质谱响应强度的比值。

3、实验结果

(1)6-苄基腺嘌呤的特征离子参数

结果如表1所示：

表1：6-苄基腺嘌呤的特征离子参数

结果如表1所示：试样待测液和标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处(±0.5％)出现，并且对应质谱碎片离子的质荷比与标准品一致。其中目标离子n1和n2是被分析目标物的定量碎片离子和定性碎片离子的精确质量数，目标离子m是被分析目标物的定量母离子(m/z)的精确质量数。

6-苄基腺嘌呤的标准离子流(tic)色谱图，如图1所示。

(2)灵敏度

结果如表2所示：

表2线性范围、线性方程、相关系数、方法检出限(lod)、方法定量限(loq)

结果如表2，6-苄基腺嘌呤在浓度为0.2ng/ml～100ng/ml范围内，具有良好的线性响应，检出限低，灵敏度高，可用于豆芽中6-苄基腺嘌呤残留检测。

(3)、回收率、精密度与富集因子

结果如表3所示：

表3回收率、精密度及富集因子试验结果(n＝6)

结果如表3，6-苄基腺嘌呤的平均回收率为68.4％～70.3％，相对标准偏差(rsd)为3.32％～7.05％，富集因子ef在39.1～44.3间，这三项指标表明本发明所选方法的准确度及精确度高，重复性好，富集倍数高，可用于豆芽中6-苄基腺嘌呤的快速富集和残留检测。

实验结果表明：本发明检测豆芽中6-苄基腺嘌呤的方法具有操作简单、使用有机试剂少、灵敏度高、重现性好、富集倍数高、定性定量准确等优点，适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤定性和定量分析。

(4)、基质效应

实验结果表明，采用不同方式定容，6-苄基腺嘌呤的质谱响应强度比值为0.74，即豆芽样品属于复杂基质，存在较强的机制抑制作用。因此本实验采用豆芽基质提取液作为定容液配制标准工作溶液进行校正补偿，并在实验中加入nacl进一步降低基质抑制效应，减少基质抑制对分析测试结果的影响和干扰。

实验例2本发明检测方法条件优化筛选试验

1实验方法

影响分散液液微萃取效率的主要因素有萃取剂类型和用量、分散剂类型和用量、超声辅助萃取时间、盐浓度、ph值等。富集因子(enrichmentfactors，ef)：目标化合物在萃取剂中的浓度与目标化合物在样品溶液中的初始浓度之比，即ef＝csed/c0。本发明采用富集因子参数ef值来考察方法萃取效率，优化了影响分散液液微萃取效率的主要因素，实现对豆芽中6-苄基腺嘌呤快速富集和测定。

(1)萃取剂类型和用量的筛选

在分散液液微萃取中，萃取剂的优化对萃取效率以及ef值有重要影响。一般萃取剂的选择需满足以下几个条件:密度比水大；对目标化合物有较好的萃取效果；在水中溶解度小；能形成稳定的两相体系。本发明以不含6-苄基腺嘌呤的豆芽作为空白样品基质，进行1倍测定低限浓度水平添加实验，选择4种常用萃取剂：二氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烷和氯苯进行比较，考察不同萃取剂类型对富集因子的影响。确定萃取剂类型后再选取20、50、100、150、200μl不同萃取剂用量，考察其对富集因子的影响。

(2)分散剂类型和用量的筛选

分散剂的类型也是影响萃取效率的一个重要因素。由于6-苄基腺嘌呤在水中溶解度低，本发明采用改良的分散液液微萃取方法，对豆芽进行先提取后萃取的前处理，选取的分散剂也作为提取液。分散液液微萃取对分散剂的要求主要有：在萃取剂中有良好的溶解性并能与水互溶，使萃取剂在体系中分散成微珠，最大限度地增加萃取剂与目标溶液的接触面积，进而提高萃取效率；对目标化合物的测定不产生干扰。本发明以不含6-苄基腺嘌呤的豆芽作为空白样品基质，进行1倍测定低限浓度水平添加实验，选择3种常用萃取剂：甲醇、乙腈。丙酮进行比较，考察不同分散剂类型对富集因子的影响。分散剂对“分散剂/水/萃取剂”乳浊液体系的形成有直接影响，其体积会改变分散剂在体系中的分散程度进而影响萃取效率。确定分散剂类型后再选取0.5、1、1.5、2、3ml不同分散剂用量，考察其对富集因子的影响。

(3)超声辅助萃取时间的影响

超声辅助萃取可以使离子液体分散成微珠，通过在溶液中不断运动，增大与目标物溶液的接触面积，使得离子液体更迅速、充分地与目标物接触，进而达到萃取平衡。在分散液液萃取实验中，平衡的建立需要一定的时间。本发明以不含6-ba的豆芽作为空白样品基质，进行1倍测定低限浓度水平添加实验，考察了2min、5min、10min、15min和20min五个不同的超声辅助萃取的时间对富集因子的影响。

(4)盐浓度的影响

在萃取实验中，加入一定浓度的盐会影响水相离子强度，产生一定的盐析效应：适当降低目标物在水相的溶解度，提高目标物在体系中的萃取效率。本发明以不含6-苄基腺嘌呤的豆芽作为空白样品基质，进行1倍测定低限浓度水平添加实验，选择0、0.1、0.5、1.0、1.5、2g/ml的nacl浓度进行比较，考察不同盐浓度对富集因子的影响。

(5)ph值的影响

本发明考察了萃取时溶液在不同ph值条件下对富集因子的影响。

2实验结果

(1)萃取剂类型和用量的筛选结果见表4、表5。

表4不同萃取剂对ef值的影响

表5不同萃取剂用量对ef值的影响

实验结果表明：四氯乙烷作为萃取剂时与分散剂形成两相体系较为稳定，ef值最大，萃取效率最高，其次是四氯化碳，而经氯苯萃取后的样液杂质较多，质谱图基线干扰较强，影响目标物的分析定量，二氯甲烷则无法与分散剂形成稳定的两相体系。因此，选取四氯乙烷作为样品的萃取剂。因此，本发明采用四氯乙烷作为样品的萃取剂。在萃取剂用量上，当溶剂体积低于100μl时，目标物的ef值与溶剂体积成正相关；高于100μl时，ef值降低。当萃取剂含量太少时，萃取剂可能会发生损失，或者与目标物接触面积过小导致萃取效率低；当萃取剂达到一定的体积后，目标物萃取效率达到峰值，达到萃取平衡后再加大萃取剂的量，目标物浓度反而降低导致ef值下降，因此本发明选取100μl作为萃取剂用量。

(2)分散剂类型和用量的筛选结果见表6、表7。

表6不同分散剂对ef值的影响

表7不同分散剂体积对ef值的影响

结果表明：以甲醇作为分散剂时，目标物ef值最大，且此时提取效率高，其次为丙酮。以乙腈作为分散剂时，只能与四氯化碳一种萃取剂形成稳定的两相体系，本发明选取甲醇作为分散剂。在用量上，采用1ml的甲醇分散剂时，目标物的ef值最大。由于在小体积分散剂作用下，萃取剂还未完全被分散，难以形成乳浊液，此时ef值随着甲醇体积的增加而增大。当甲醇体积过大会使目标化合物在样液中的溶解度增大，不易被萃取剂萃取，导致萃取效率降低。因此本发明采用1ml作为分散剂用量。

(3)超声辅助萃取时间的影响结果

结果见表8

表8不同超声时间对ef值的影响

结果表明：体系中加入分散剂和萃取剂，ef值在超声辅助萃取10min后可达到最大值，10min后萃取效率随萃取时间的增大无明显改变，这表明萃取时间非常短即可达到两相体系的萃取平衡。

(4)盐浓度的影响结果

见表9

表9不同盐浓度对ef值的影响

结果表明：在样液中添加1.5gnacl后可以有效提高萃取效率，且ef值最大，如表9。若nacl加入量过大则导致无法在体系中完全溶解，影响后续离心后底层沉积相的实验操作，故本发明选取1.5g/ml作为添加的nacl浓度。

(5)ph值的影响结果

结果表明，富集因子ef值受ph值的影响不大。因此本发明采用在中性溶液条件下进行。

实验结果表明：经过对检测方法的条件进行优化筛选，本发明检测方法具有操作简单、有机溶剂消耗量小，萃取效率高、能有效排除提取过程中其他化合物的干扰的优点，对目标化合物进行快速富集萃取，适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤的定性和定量分析。

综上，本发明检测6-苄基腺嘌呤稳定性高，检测限低，萃取效率高，富集倍数大，有机溶剂消耗量小，易于操作，适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤的快速定性和定量分析，具有良好的应用前景。