一种检测难治性癫痫病的液相芯片试剂盒的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种检测难治性癫痫病的液相芯片试剂盒。

背景技术：

癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑部神经元高度同步化异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫是神经系统常见疾病之一，患病率仅次于脑卒中。癫痫的发病率与年龄有关，一般认为1岁以内患病率最高，1～10岁以后逐渐降低。我国癫痫患者男女比例为1.15～1.7:1。

难治性癫痫病又称之为顽固性癫痫，通常指无中枢神经系统进行性疾病或占位性病变，但临床迁延，经2年以上正规抗癫痫治疗，试用主要抗癫痫药单独或合用，达到患者能耐受最大剂量，血药浓度达到有效范围，仍不能控制发作，且影响日常生活，方可确定为难治性癫痫，难治性癫痫约占癫痫病人的20％～30％。难治性癫痫病因繁多，大部分存在脑补病损，如海马硬化、脑外伤、肿瘤、结节性硬化和先天性发育异常等。快速且准确的诊断癫痫对临床医生针对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要意义。

lafrance等人研究发现，timp-1在癫痫患者血清中的含量较正常人低，有望成为癫痫的血清biomarker，但其只是在小样本实验中有用，而在大样本癫痫患者血清中timp-1的水平与正常组之间没有显著性差异。另外，最近还有hsp70、s100b、nse等指标在难治性癫痫患者血清水平较正常人高的报道，但均因检测方法不稳定、检测方法信噪比差等原因，造成结果重复性不好、可靠度不高等问题，而不能大规模的应用。microrna作为癫痫诊断标志物可行性也有研究和报道，但由于样本量少、检测方法的特殊要求及费用昂贵等原因，其结果的可靠性、临床意义和推广性均有待于进一步考证。

癫痫患者脑组织及脑脊液中的mmps含量明显高于正常人，mmps是一个含锌离子的肽链内切酶家族，共分离出23个家族成员，编号分别为mmp1～23。mmps的活性可以被金属蛋白酶组织抑制因子(timps)调节，正常生理状态下，mmps与timps共同调控细胞外基质(ecm)的更新，维持血脑屏障、细胞膜及细胞的稳定，但是如果mmps/timps失衡，则中枢神经系统的结构、神经化学递质和影响细胞再生及死亡的渠道将被改变，从而产生慢性癫痫的基础。然而，国内外在mmps作为诊断标志物的高水平研究尚十分匮乏。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供一种检测难治性癫痫病的液相芯片试剂盒，以达到及时发现并准确诊断癫痫的目的。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种检测难治性癫痫病的液相芯片试剂盒，该试剂盒包括包括包被微球、生物素标记的检测抗体、链霉素、反应缓冲液和反应稀释液；其中，

包被微球包括包被timp-1捕获抗体的微球、包被mmp2捕获抗体的微球、包被mmp3捕获抗体的微球和包被mmp9捕获抗体的微球，每种微球的浓度均为3×10⁶～8×10⁶个/ml，且包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码；

检测抗体包括timp-1检测抗体、mmp2检测抗体、mmp3检测抗体和mmp9检测抗体，每种检测抗体的浓度均为0.08～0.12μg/ml；

反应缓冲液为ph为7.0～7.5的pbs缓冲液；

稀释缓冲液为包括0.05wt％～0.15wt％bsa的pbs缓冲液，其ph值为7.0～7.5。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，试剂盒中每种包被微球的浓度均为5×10⁶个/ml。

进一步，试剂盒中每种检测抗体的浓度均为0.1μg/ml。

进一步，稀释缓冲液中bsa的质量分数为0.1wt％。

本发明的有益效果是：本发明的液相芯片试剂盒的敏感度高，通过多个标志物联合检测，大大提高了难治性癫痫病早期诊断的准确率，且检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，且成本低廉。

附图说明

图1为本试剂盒中各个检测指标的标准曲线，其中a为timp-1的标准曲线；b为mmp2的标准曲线；c为mmp3的标准曲线；d为mmp9的标准曲线；

图2为液相芯片技术检测血清mmp-2含量；

图3为癫痫患者及正常对照组中血清mmp-2水平；

图4为液相芯片技术检测血清mmp-3含量；

图5为癫痫患者及正常对照组中血清mmp-3水平；

图6为液相芯片技术检测血清timp-1含量；

图7为利用血清mmp-2水平作为癫痫患者和正常对照组的诊断标志物时的roc曲线；

图8为利用血清mmp-3水平作为癫痫患者和正常对照组的诊断标志物时的roc曲线；

图9为利用血清timp-1水平作为癫痫患者和正常对照组的诊断标志物时的roc曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一、液相芯片的制备

1.制备包被微球

(1)取微球悬液(磁性微球，bio-rad)，依次涡旋和超声约20s后，取250μl(约5×10⁶个微球)于干净离心管(美国，axygen)中，标记上微球型号和蛋白名称；然后放入离心机中，室温下14000g分离4min，再吸去上清液；

(2)向离心管中加入100μlddh2o，依次涡旋和超声约20s，再在室温下14000g分离4min，吸去上清液；

(3)向离心管中加入160μlph为6.2、浓度为0.1m的nah2po4，依次涡旋和超声约20s，然后加入20μln-羟基硫代琥珀酰亚胺(s-nhs)，涡旋混匀，再加入20μl1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)，依次涡旋和超声约20s；然后在室温下避光旋转孵育20min(若发现微球不呈悬浮状态，可每隔10min涡旋一次)，随后14000g分离4min，吸去上清液；

(4)向经过步骤(3)处理后的体系中加入250μlph为5.0、浓度为0.05m的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，依次涡旋和超声约20s，随后14000g分离4min，吸去上清液；

(5)用50μlph为5.0、浓度为0.05m的mes重悬微球，分别涡旋和超声约20s；

(6)加25μg捕获抗体于上述微球中，加入ph为5.0、浓度为0.05m的mes至终体积为500ul，分别涡旋和超声约20s，然后在室温下避光旋转孵育2h，再14000g分离4min，吸去上清液；

(7)向经过步骤(6)处理的体系中加入1mlpbs缓冲液，室温避光旋转孵育30min，再14000g分离4min，吸去上清液；在离心管上标记微球浓度、偶连时间，然后放置4度避光保存，完成包被微球的制备。

按照上述方法，制备3种捕获抗体包被微球，分别为：包被了timp-1捕获抗体的34#微球、包被mmp2捕获抗体的45#微球、包被mmp9捕获抗体的26#微球。

2.构建芯片试剂盒

本发明中在构建试剂盒时，将3种制备好的包被微球均匀混合后放入试剂盒中，并保证每种包被微球的浓度相同，均处于3×10⁶～8×10⁶个/ml的范围内；除此之外，试剂盒内还放有检测抗体、链霉素-r藻红蛋白、反应缓冲液、稀释缓冲液、封口膜和96孔板等；试剂盒内的检测抗体包括timp-1检测抗体、mmp2检测抗体、mmp3检测抗体和mmp9检测抗体，每种检测抗体均用生物素标记过，且每种检测抗体的浓度均为0.08～0.12μg/ml；试剂盒中的反应缓冲液为ph为7.0～7.5的pbs缓冲液，稀释缓冲液为包括0.05wt％～0.15wt％bsa的pbs缓冲液，其ph值为7.0～7.5。

实施例二、试剂盒用于检测难治性癫痫病

1.检测方法

(1)使用前先从试剂盒内取出所有试剂，放置至室温；

(2)取出患有癫痫的恒河猴和健康恒河猴的海马组织，分别放置在冰上融化后，涡旋混匀，取96孔板将海马组织稀释20倍；

(3)准备timp-1、mmp2、mmp3和mmp9标准蛋白，各取7个ep管分别标记上s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7，进行2倍系列稀释，每一个标准蛋白稀释后都要涡旋混匀并更换枪头；

(4)取一96孔板，打开洗板机--prime--rinse(channel2)--prime--放置plate--run5：magx3；

(5)取制备好的捕获抗体包被微球，涡旋混匀20s，超声20s，按每孔2500个微球加入到1％pbs中，涡旋混匀20s，超声20s，终体积为10μl/孔；

(6)立即加入稀释20倍的海马组织和系列稀释的标准蛋白(抗体的不同孔中加入海马组织或者不同稀释倍数的标准蛋白)，各30μl/孔；

(7)用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min；

(8)用包括0.1wt％bsa的pbs缓冲液洗三次，run5：magx3；

(9)用ph为7.0～7.5的pbs缓冲液稀释生物素标记的检测抗体(生物素标记的timp-1检测抗体、mmp2检测抗体、mmp3检测抗体和mmp9检测抗体)，50μl/孔；

(10)用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min；

(11)用包括0.1wt％bsa的pbs缓冲液洗三次，各种抗体的浓度均为0.1μg/ml，run5：magx3；

(12)用ph为7.0～7.5的pbs缓冲液稀释链霉素-r藻红蛋白(1：500)，50μl/孔；

(13)用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min；

(14)用包括0.1wt％bsa的pbs缓冲液洗三次，run5：magx3；

(15)100μl/孔的1％pbs重悬微球，室温，震荡3～5min；

(16)于luminex系列液相芯片分析仪上读取结果，仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样本的测量值。

2.结果分析

图1为本发明试剂盒中各个检测指标的标准曲线。图2和图3分别为液相芯片技术检测血清mmp-2含量和癫痫患者及正常对照组中的血清mmp-2水平；从图2和图3可以看出(图中ctl为正常对照组；ep为癫痫患者组)，不论是在癫痫患者或者是正常对照组中，血清mmp-2水平随年龄的增加不断下降，而且血清mmp-2水平在癫痫患者中明显比正常对照组低。图4和图5分别为液相芯片技术检测血清mmp-3含量和癫痫患者及正常对照组中的血清mmp-3水平；从图4和图5可以看出，不论是在男性或者是女性组中，癫痫患者血清mmp-3水平随年龄的增加不断增高(p<0.05)，而且血清mmp-3水平在癫痫患者中明显比正常对照组低，并且女性mmp-3血清水平较男性明显减低，差异具有统计学意义(p<0.05)。图6为液相芯片技术检测血清timp-1含量，从图中可以看出，血清timp-1水平与年龄无明显相关性(p>0.05)。

图7和图8分别为不同年龄段的癫痫患者和正常对照关于mmp-2和mmp-3的roc曲线，从中可以看出，当浓度取175.40ng/ml时，血清mmp-2作为癫痫与正常对照诊断指标的灵敏度为71.13％，特异度为62.66％；在20-40岁年龄组，当男性和女性的血清mmp-3浓度分别为23.87ng/ml和12.31ng/ml时，其诊断敏感度分别为72.22％和45％，特异度分别为76.67％和94.12％；在大于40岁年龄组，当男性和女性的血清mmp-3浓度分别为20.70ng/ml和10.92ng/ml时，其诊断敏感度分别为85.71％和85.62％，特异度分别为47.62％和100％。图9为利用血清timp-1水平作为癫痫患者和正常对照组的诊断标志物时的roc曲线，血清timp-1浓度取74.35ng/ml时，timp-1作为癫痫与正常对照诊断指标的灵敏度为66.52％，特异度为59.80％，auc0.594。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。