一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中的检测试剂盒，特别是涉及检测疾病的试剂盒，尤其是涉及一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒。
背景技术：
：非洲猪瘟（africanswinefever，asf）是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。非洲猪瘟病毒（africanswinefevervirus，asfv）是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。由于该病的高发病率和高致死率对养猪业可造成巨大的经济损失，中国将非洲猪瘟规定为一类动物传染病，世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病。建立快速、灵敏、特异的检测方法对于asfv的防控至关重要。目前，asf诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光实验、间接免疫荧光实验、检测病毒核酸等方法。其中核酸检测方法因其简单的操作和高度的敏感性而被广泛应用。检测asfv核酸的方法有普通聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应等。试纸条是一种简单方便灵敏的现场快速检测产品，已被广泛应用于检测行业。目前，大多是使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，成本高，反应不够快速。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒。本发明设计了非洲猪瘟的特异性pcr引物，利用纳米金直接标记于引物，开发了一种基于pcr试纸条技术的非洲猪瘟鉴别试剂盒；相比使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，该方法借助于双链互补原则，以及普通pcr，降低了试剂盒成本，实现简单快速低成本的现场检测。本发明提供的一种快速检测非洲猪瘟的试纸条，包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针；所述质控探针的核苷酸序列如seqidno.1所示。上述的试纸条中，形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/ml~10mg/ml，具体可为5mg/ml或4mg/ml~8mg/ml；形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/ml；所述质控探针的浓度可为100μm；所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时。本发明还提供了一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒，包括快速检测非洲猪瘟的试纸条、引物对和缓冲溶液；所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针；所述引物对为5'端标记纳米金的上游引物和修饰生物素的下游引物。本发明中，所述引物对用于扩增非洲猪瘟病毒。上述的试剂盒中，所述质控探针的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.2和seqidno.3；形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/ml~10mg/ml，具体可为5mg/ml或4mg/ml~8mg/ml；形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/ml；所述质控探针的浓度可为100μm；所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时；所述缓冲溶液为tebuffer。本发明还提供了一种利用上述的试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：（1）将待测样品置于具有所述引物对的pcr扩增体系进行pcr反应，得到扩增产物；（2）所述扩增产物与缓冲溶液混合，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫，检测结果如下：1）当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性；2）当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性；3）当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。本发明中，所述pcr反应过程如下：95℃，4min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，30个循环；72℃，10min。上述的方法步骤（1）中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；具体使用的待测引物为1μl，引物用量2μl；所述扩增产物与所述缓冲溶液的体积比为1:5~9，具体可为1:6。本发明还提供了一种用于非洲猪瘟病毒检测的引物对，该引物对为5'端标记纳米金的上游引物和修饰生物素的下游引物。上述的引物对中，制备所述5'端标记纳米金的上游引物包括如下步骤：将纳米金胶体溶液与上游引物在避光下放置反应；然后加pb缓冲液，并加nacl水溶液稀释，放置反应，即得所述5'端标记纳米金的上游引物。上述的引物对中，所述纳米金胶体溶液中纳米金胶体的粒径为13~25nm，具体可为13nm，所述上游引物的浓度为100μm；所述纳米金胶体溶液与所述上游引物的体积比为25~50：1，具体可为25:1；在所述避光下放置反应时间为16~24h，具体可为6h；所述pb缓冲液的浓度为10mm，所述上游引物与所述pb缓冲液的体积比为1:2.8；加2mnacl水溶液将体系稀释至0.3m，然后反应的时间为8~12h，具体可为8h；得到所述5'端标记纳米金的上游引物的后处理步骤如下：离心，除上清；然后重悬于nacl水溶液和pb缓冲液中，备用。本发明中，制备所述5'端标记纳米金的上游引物具体包括如下步骤：将500μl纳米金（胶体金溶液，13nm）与20μl100μm上游引物在避光下放置16h，加10mmpb缓冲液56μl，加2mnacl至0.3m，放置8h；4℃，16100×g离心30min，除上清；最后重悬于0.3mnacl和10mmpb缓冲液中，置于4℃备用。本发明进一步提供了一种用于非洲猪瘟病毒检测的扩增体系，该体系包括上述引物对、一种或多种dna聚合酶、dntps、缓冲液和ddh2o。上述的扩增体系中，所述缓冲液包括tebuffer。本发明具有以下优点：本发明设计了非洲猪瘟的特异性pcr引物，利用纳米金直接标记于引物，开发了一种基于pcr试纸条技术的非洲猪瘟鉴别试剂盒。其使用方法操作简单，普通pcrmix大大降低了试剂盒的成本，仅需pcr扩增仪完成扩增，结果可用肉眼，在10min内观察结果，无需特殊检测仪器；相比使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，该方法借助于双链互补原则，以及普通pcr，降低了试剂盒成本，实现简单快速低成本的现场检测。附图说明图1为本发明试剂盒检测原理。图2为本发明采用不同引物对的凝胶电泳结果。图3为本发明试剂盒特异性实验的检测结果，其中图3（a）为引物对不同病毒的质粒dna模板的电泳结果，图3（b）为本发明试剂盒中引物对不同病毒的质粒dna模板的检测结果。图4为本发明试剂灵敏度实验的检测结果，图4中从左到右分别是106、105、104、103、102、101、1拷贝/μl拷贝/ul。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，2×taqmastermixforpage购自北京百诺威生物科技有限公司；引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。核酸试纸条购自北京雁栖湾生物科技有限公司；电泳仪购自bio-rad公司；凝胶成像系统（alphalmagerep）购自美国uvp公司；紫外分光光度计购自thermo有限生物公司；微量离心机购自thermofisherscientific公司。胶体金溶液（13nm）；链霉亲和素、氯化钠、叠氮化钠、pbs缓冲液、pb缓冲液、te缓冲液均购自北京百诺威生物科技有限公司；水浴锅；nanodrop-2000（gene公司）；离心管：0.1ml、1.5ml、2ml；计时器；移液枪：量程0.5μl~10μl、10μl~100μl、100μl~1000μl；无菌去离子水。asfv质粒源于上海生工生物工程技术服务有限公司。实施例、1、试纸条的制备将链霉亲和素按照包被浓度5mg/ml包被在反应膜上形成检测区；将1mg/ml的链霉亲和素或生物素与100μm的质控探针在室温下反应两个小时后，在反应膜上做为质控区，得到包被检测区与质控区的反应膜。试纸条由样品吸收垫（上海杰一生物技术有限公司，jy-bx111），上述制备的包被检测区和质控区的反应膜、吸水垫依次按照顺序黏贴在底板上。质控探针的核苷酸序列如seqidno.1和如表1中control所示。2、挑选引物：本发明设计了如表1所示的不同引物对zf1~zf3，经过如图2所示的凝胶电泳比对可知，zf1和zr1的阳性条带最为清晰明亮，选zf1和zr1作为最佳引物对。zf1上游引物的5'端标记纳米金，zr1下游引物修饰生物素。引物设计使用primerpremier5.0软件，引物序列如表1所示。zf1、zr1、zf2、zr2、zf3、zr3的核苷酸序列分别如seqidno.2、seqidno.3所示、seqidno.4-7所示。5'端标记纳米金的上游引物zf1的制备：上游引物与试纸条的质控探针的核苷酸序列互补，将纳米金标记在上游引物上后，将反应产物与上样缓冲液tebuffer，滴加在试纸条上。若产物中有目标序列，则试纸条的检测区上的链霉亲和素抓住下游引物的生物素，上游引物的纳米金在检测区显色。若无目标序列，检测区不能显色，在质控区质控探针序列与金标引物互补，进行质控。金标引物的制备：将500μl纳米金（胶体金溶液，13nm）与20μl100μm上游引物在避光下放置16h，加10mmpb缓冲液56μl，加2mnacl至0.3m，放置8h。4℃，16100×g离心30min，除上清。最后重悬于0.3mnacl和10mmpb缓冲液中，置于4℃备用。表1引物及探针序列primersequences（5'-3'）zf1hs-c6-cctactcaccacgcagagatzr1bio-ttgcattgcctccgtagtggzf2agctcttccagacgcatgttzr2cgtggcttcaaagcaaaggtzf3gatgatccgggtgcgatgatzr3ccacgtaatccgtgtcccaacontrolbio-atctctgcgtggtgagtagg注：表1中，zf1的核苷酸序列的5'端连接c6表示（6个亚甲基，ch2）和巯基（sh），其中纳米金与巯基中硫连接；zr1的核苷酸序列的5'端连接bio表示生物素，质控探针的核苷酸序列control的5'端连接bio表示链霉亲和素或生物素。3、快速检测非洲猪瘟的试剂盒由本发明上述1中制备的试纸条、2中引物对和缓冲溶液（tebuffer）组成。4、快速检测非洲猪瘟的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：（1）用非洲猪瘟的质粒dna用2×taqmastermixforpage进行扩增并用电泳检测扩增产物。pcr反应体系为：25μl的反应缓冲液、2μl的上游引物与2μl的下游引物、1μl的dna模板、20μl的ddh2o。反应过程：95℃，4min。95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，30个循环。72℃，10min。（2）将10μl增产物与60μltebuffer混合，然后滴加至上述试纸条的检测区，检测结果如下：1）当检测区显色，且质控区也显色，则待测样品检测结果为阳性；2）当检测区不显色，且质控区显色，则待测样品检测结果为阴性；3）当质控区不显色，则试纸条无效，需要用新的试纸条重新测定。本发明试剂盒检测原理：核酸试纸条检测非洲猪瘟质粒dna的原理如图1。使用一对特异性引物扩增从非洲猪瘟质粒中获得的dna，上游引物标记纳米金，下游引物的5'端修饰有生物素。扩增产物纯化后与展开液滴加在试纸条上，混合液通过毛细管作用向前流动。当有扩增产物存在时，扩增产物随着液相向前流动到达检测线，固定在检测线上的链霉亲和素将一端修饰有生物素的扩增产物捕获，这样就使被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终与质控线上的质控探针序列结合，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而与质控线上的质控探针序列结合，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条进行质控。特异性实验：根据上述确立的反应体系进行特异性实验，使用本发明中设计的引物对不同病毒的质粒dna模板（asfv阳性质粒以及猪圆环病毒2型（pcv-2）、猪瘟病毒（csfv）、猪传染性胃肠炎病毒（tgev）、猪流行性腹泻病毒（pedv）阳性dna或cdna）进行实验，检测结果如图3所示，由图3（a）结果显示除了asfv阳性质粒外，其他几个病毒的质粒均没有扩增，从而证明本发明的特异性良好。电泳结果与试纸条结果一致，如图3（b）所示。灵敏度实验：为了确定本方法的最小检出量，将合成的质粒标准品稀释成106、105、104、103、102、101、1拷贝/μl等7个浓度梯度后作为模板进行检测。结果如图4所示，本方法具有较广的检测范围，其最低检测限为101拷贝/μl（图4）。序列表<110>中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所<120>一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒<130>gnclw190135<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atctctgcgtggtgagtagg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cctactcaccacgcagagat20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttgcattgcctccgtagtgg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agctcttccagacgcatgtt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cgtggcttcaaagcaaaggt20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gatgatccgggtgcgatgat20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccacgtaatccgtgtcccaa20当前第1页12